Eusebiu Vlad Gorduza

Prenatal diagnosis of 21 trisomy by quantification of methylated fetal DNA in maternal blood: study on 10 pregnancies

Abstract Background. The Down syndrome is a severe disease without pathogenic therapy. The only possibility to reduce the consequences of disease is prenatal screening and diagnosis. The gold standard in prenatal diagnosis is the conventional banding cytogenetic analysis of fetal cells obtained by invasive procedures. To reduce the complications, in the last years different methods to detect fetal cells or DNA in maternal blood were developed. Aim. The aim of study was to verify the reliability of quantification by immunoprecipitation of methylated fetal DNA in maternal blood in the prenatal diagnosis of 21 trisomy. Method. We analyzed probes from 12 pregnant women (7 with confirmed 21 trisomy pregnancy and 5 with normal pregnancy), with two being rejected for technical considerations. For each probe we carried out: extraction of total DNA (maternal and fetal), DNA fragmentation, immunoprecipitation of methylated DNA, washing, isolation of DNA and qPCR for immunoprecipitated DNA. To highlighting specific methylated regions on fetal 21 chromosome we used eight pairs of specific primers for chromosome 21. Finally we analysed the results of qPCR applying the formula D=- 6.331+0.959XEP4+1.188XEP5+0.424XEP6+0.621XEP7+0.028XEP8+0.387XEP10-0.683XEP11+ 0.897XEP12, where XEPi= fraction value for each marker. Results. In all normal pregnancies the value of D factor was negative concordant with absence of trisomy (100% specificity). In 5 from 6 pregnancies with 21 trisomy the value of D factor was positive, which indicated a high sensibility. However, to a precise estimation of this method is required a larger number of cases that allowing the obtaining of statistically validated results. Rezumat Introducere. Sindromul Down este o boală gravă, lipsită de terapie patogenică. Singurele posibilităţi de reducere a consecinţelor bolii le reprezintă screeningul şi diagnosticul prenatal. Standardul de aur în diagnosticul prenatal este analiza cromosomică a celulelor fetale obţinute prin proceduri invazive. Pentru reducerea complicaţiilor, în ultimii ani au fost dezvoltate diferite metode de detecţie a celulelor sau ADN-ului fetal în sângele matern. Scop. Scopul studiului a fost verificarea aplicabilităţii metodei de cuantificare prin imunoprecipitare a ADN-ului fetal metilat din sângele matern în diagnosticul prenatal al trisomiei 21. Metodă. Am analizat probe de la 12 gravide (7 cu făt cu trisomie 21 şi 5 cu făt euploid confirmate citogenetic), două probe fiind eliminate din considerente tehnice. Pentru fiecare probă am efectuat: extracţia ADN-ului total (matern şi fetal), fragmentarea ADN-ului, imunoprecipitarea ADN-ului metilat, spălarea, izolarea ADN-ului şi qPCR pentru ADN-ul imunoprecipitat. Pentru evidenţierea regiunilor metilate specifice pe cromosomii 21 fetali am utilizat opt perechi de amorse specifice cromosomului 21. În final, am analizat rezultatele qPCR aplicând formula: D=-6,331+0,959XEP4+1,188XEP5+0,424XEP6+0,621XEP7+0,028XEP8+0,387XEP10-0,683XEP11 +0,897XEP12 unde XEPi= valoarea fracţiei pentru fiecare marker. Rezultate. În toate sarcinile normale, valoarea factorului D a fost negativă concordant cu absenţa trisomiei (specificitate 100%). În 5 din 6 sarcini cu trisomie 21 valoarea factorului D a fost pozitivă, ceea ce indică o sensibilitate crescută. Totuşi, pentru estimarea precisă a metodei este necesară analiza mai multor cazuri, ceea ce ar permite obţinerea de date valabile statistic

Campomelic dysplasia with dextrocardia and without sex-reversal

Campomelic dysplasia (CD) is a very rare, sporadic, autosomal dominant syndrome. CD is characterized by an association of skeletal (bowed long bones, pelvis and chest abnormalities, eleven rib pairs) and extraskeletal abnormalities (facial dysmorphism, sex-reversal in boy and visceral malformations). We report a case of a 3 days old male diagnosed by CD. At birth, the boy displayed severe asphyxia and therefore needed intensive care. Physical examination revealed short stature, a craniofacial dysmorphism, cleft palate, muscle hypotonia, skeletal anomalies (chest hypoplasia, curved short upper and lower limbs, talipes equinovarus ) cardiac malformations, normal male genitalia. The X-ray examination showed bell-shaped, narrow thoracic cage, hypoplastic scapulae, reduced cranial, pelvic, tibial and fibular ossification, absence of nasal and sternal ossification, cervical kyphosis, 11 pairs of ribs, flat and short vertebral bodies, short humerus with widened distal epiphysis, anterolateral femoral and tibial bowing and ankle valgus deformity. Dextrocardia was identified on X-ray examination and on echocardiography. Karyotype was 46,XY. The particularities of cases are campomelic dysplasia with dextrocardia, but without sex-reversal.

Prenatal diagnosis of triploidy in second trimester of pregnancy: a series of 4 cases over an eleven-year period / Diagnosticul prenatal al triploidiei în trimestrul al II-lea de sarcină: o serie de patru cazuri depistate în unsprezece ani

Abstract Triploidy is a numerical chromosomal anomaly characterized by the presence of three sets of haploid chromosomes. The incidence is hard to evaluate, because usually it causes 1st trimester miscarriage. At 20 weeks of amenorrhea the incidence of triploidy is estimated at 1/250,000 cases. We present 4 cases of triploidy diagnosed during the decade 2003-2013 in the Prenatal Diagnosis Department of Maternity “Cuza-Vodă” Iasi, Romania, all registered in one year. The analysis of pathological cases identified in the last 11 years by prenatal diagnosis has shown that triploidies represented only 5.7% of numeric chromosomal anomalies, but in 2013 the four cases of triploidy represented 36% of numeric chromosomal anomalies. The karyotypes were recommended after discovering different congenital anomalies by ultrasound scan. In all cases, an intrauterine growth retardation (IUGR) was present but with no placental changes. Also, we discovered anomalies of limbs, congenital anomalies of heart and some dysmorphic features. This series demonstrates that triploidy may be discovered in the 2nd trimester of pregnancy and has a heterogeneous aspect at ultrasound scan, which can generate diagnostic difficulties. Therefore, the detection by ultrasound scan, at 18-22 weeks of pregnancy, of complex foetal morphological abnormalities should be an important reason for amniocentesis to search chromosomal anomalies Rezumat Triploidia este o anomalie cromosomică numerică, caracterizată prin prezenţa a trei seturi haploide de cromosomi. Incidenţa triploidiei este dificil de evaluat, deoarece de obicei produce avort spontan în primul trimestru de sarcină. Incidenţa estimată a triploidiei la 20 de săptămâni de gestaţie este de 1/250.000 sarcini. În acest articol prezentăm patru cazuri de triploidie diagnosticate in perioada 2003-2013 în Departamentul de Diagnostic Prenatal al Maternităţii “Cuza Vodă” Iaşi, România, toate fiind identificate pe parcursul anului 2013. Analiza cazurilor patologice identificate în ultimii 11 ani prin diagnostic prenatal a arătat că triploidia reprezintă doar 5,7% din anomaliile cromosomice numerice, dar raportat la anul 2013 cele patru cazuri de triploidie reprezintă 36% din anomaliile cromosomice numerice. În toate cazurile analiza cromosomică a fost efectuată după descoperirea prin ecografie fetală a diverse anomalii congenitale. În toate cazurile a fost identificată o întârziere de creştere intrauterină, dar nu au fost depistate modificări placentare. De asemenea, au fost găsite anomalii ale membrelor, anomalii congenitale de cord şi unele aspecte dismorfice. Această serie de cazuri demonstrează faptul că triploidia poate evolua până în al doilea trimestru de sarcină şi că aspectele ecografice sunt eterogene, ceea ce generează unele dificultăţi de diagnostic. De aceea, identificarea la 18-22 de săptămâni de sarcină a unui complex de anomalii morfologice fetale trebuie să reprezinte un motiv important pentru efectuarea amniocentezei şi a analizei cromosomice

Co-expression of the CBFβ-MYH11 and BCR-ABL fusion genes in chronic myeloid leukaemia / Coexistenţa genelor de fuziune CBFβ-MYH11 şi BCR-ABL în leucemia mieloidă cronică

Abstract The coexistence of t(9;22) and inv(16) has been described in a very limited number of cases of CML, de novo or therapy-related AML. We report a patient with CML who presented both inversion of chromosome 16 and Philadelphia chromosome and evolved towards the blast phase under treatment with Imatinib. Laboratory diagnosis and monitoring was made by flow cytometry, conventional cytogenetics and molecular genetics techniques. The inv(16), detected by karyotyping in the Philadelphia chromosome positive clone at the moment of the blast transformation, was retrospectively assessed by means of real-time PCR, and was proved to have been present since diagnosis. The bone marrow biopsy performed in the blast phase of CML confirmed the presence of blasts belonging to the myeloid lineage, with indications of monocytic differentiation, frequently associated with inv(16). Moreover, the case also associated a F359V tyrosine kinase domain mutation, resulting in intermediate resistance to Imatinib and Nilotinib, which imposed therapy-switch to Dasatinib. In our case the evolution was progressive, followed by death due to lack of response to tyrosine kinase inhibitors, 18 months after diagnosis. The coexistence of t(9;22) and inv(16) in CML seems to be associated with an aggressive clinical evolution and resistance to tyrosine kinase inhibitor therapy. Due to the very small number of cases described in literature, therapeutic decisions are still difficult for patients displaying these abnormalities Rezumat Coexistenţa t(9;22) şi a inv(16) a fost descrisă într-un număr limitat de cazuri de LMC, LAM de novo sau LAM post chimioterapie. Raportăm un pacient cu LMC care a prezentat atât inversie de 16 cât şi cromozom Philadelphia şi care a evoluat spre criză blastică sub tratament cu Imatinib. Diagnosicul de laborator şi monitorizarea s-a realizat prin citometrie în flux, citogenetică convenţională şi tehnici de genetică moleculară. Inv(16), detectată prin cariotipare în clona Philadelphia pozitivă la momentul transformării blastice, a fost evaluată retrospective prin metoda real-time PCR, şi s-a dovedit a fi fost prezentă încă de la diagnostic. Biopsia de măduvă osoasă, efectuată în faza blastică a LMC, a confirmat prezenţa blaştilor aparţinând liniei mieloide, cu indicii de diferenţiere monocitoidă, frecvent asociată cu inv (16). De asemenea, cazul a asociat şi mutaţia F359V în domeniul kinazic al ABL, care determină rezistenţă intermediară la Imatinib şi Nilotinib, ceea ce a impus schimbarea terapiei cu Dasatinib. În cazul prezentat evoluţia a fost progresivă, urmată de deces ca urmare a lipsei de răspuns la inhibitorii de tirozin kinază, la 18 luni de la diagnosticare. Coexistenţa t(9; 22) şi inv(16) în LMC pare a fi asociată cu o evoluţie clinică agresivă şi rezistenţă la terapia cu inhibitori de tirozin kinază. Având în vedere numărul foarte mic de cazuri descrise în literatura de specialitate, deciziile terapeutice în cazul pacienţilor care prezintă aceste anomalii sunt încă dificile

Detection of chromosomal imbalances using combined MLPA kits in patients with syndromic intellectual disability

Abstract Intellectual disability (ID) is a common disorder, with major consequences for individual, family and society. Due to clinical and genetic heterogeneity of ID, in about 50% of cases an etiologic diagnosis cannot be established. The aim of this study was to evaluate the ability of a combination of MLPA kits to establish the diagnosis in 369 patients with syndromic ID and normal or uncertain routine karyotype results. All patients were assessed for chromosome imbalance using SALSA MLPA P064 or P096 kits, if the phenotype was suggestive of a microdeletion syndrome (subgroup A - 186 patients), or subtelomeric P036 and P070 kits, if the phenotype was not suggestive of a microdeletion syndrome or if the result of the standard karyotype was uncertain (subgroup B - 183 patients). Abnormal results detected by these kits were further characterized using appropriate follow-up MLPA kits (Telomere Follow-up set, P029-A1, P250-B2, ME028-B1). In subgroup A we identified 25 patients with microdeletions (13.4%). Using subtelomere screening and follow-up kits in subgroup B we detected cryptic rearrangements in 7.5% cases and identified the origin of the unknown material noticed in the standard karyotype in 10 out of 11 patients. Summarizing data from the two groups, the combined use of MLPA kits led to the diagnosis in 10.6% (38/358) patients with normal karyotype. Using follow-up MLPA kits allowed us both to confirm abnormalities and to determine their size, which facilitated the interpretation of the clinical significance of these rearrangements. For laboratories that do not have yet access to microarray technology, using several MLPA kits represents an effective strategy for establishing the diagnosis in ID patients. Rezumat Dizabilitatea intelectuală (DI) este o afecțiune frecventă, cu consecințe majore pentru individ, familie și societate. Datorită heterogenității sale clinice și genetice, în aproximativ 50% din cazuri etiologia bolii nu poate fi stabilită. Scopul acestui studiu a fost evaluarea capacității de stabilire a diagnosticului etiologic la 369 pacienți cu DI sindromic și rezultat normal sau incert la cariotip folosind o combinație de kituri MLPA. Toţi pacienţii au fost investigaţi prin metoda MLPA, folosind fie kiturile SALSA MLPA P064 sau P096, dacă fenotipul a fost sugestiv pentru un sindrom cu microdeleţie (subgrupul A - 186 pacienți), fie kiturile subtelomerice P036 și P070, dacă fenotipul nu a fost sugestiv pentru un sindrom cu microdeleţie sau rezultatul la cariotipul standard a fost incert (subgrupul B - 183 pacienți). Rezultatele anormale detectate de aceste kituri au fost caracterizate folosind kiturile MLPA corespunzătoare de urmărire (Telomere Follow-up set, P029-A1, P250-B2, ME028-B1). În subgrupul A am identificat 25 de pacienți cu microdeleții (13,4%). Folosind kiturile de screening subtelomeric și de urmărire la subgrupul B am detectat rearanjări criptice în 7,5% din cazuri și am identificat originea materialului suplimentar observat la cariotipul standard la 10 din 11 pacienți. Sumarizând datele obţinute din cele două loturi, folosirea combinată a seturilor MLPA a dus la stabilirea diagnosticului la 10,6% (38/358) dintre pacienții cu cariotip normal. Folosirea seturilor MLPA de urmărire a permis atât confirmarea prezenţei anomaliei, cât şi determinarea dimensiunii ei, ceea ce a facilitat interpretarea semnificaţiei clinice a rearanjărilor. Pentru laboratoarele care nu au acces la tehnologiile bazate pe microarray, folosirea mai multor kituri MLPA reprezintă o strategie eficientă pentru stabilirea diagnosticului etiologic la pacienţii cu DI.