Gerhard Schramm

Die Infektiosität der Nucleinsäure aus Tabakmosaikvirus

Die durch kurzzeitige Phenolbehandlung des Tabakmosaikvirus isolierte Ribonucleinsäure hat infektiöse Eigenschaften. Es wurde gezeigt, daß der Effekt nicht auf Beimengungen von intaktem Virus beruht oder von der Anwesenheit kleinerer Mengen von nativem Virusprotein abhängt. Somit erscheint die Ribonucleinsäure als diejenige Komponente des Virus, die den Reproduktionsvorgang bewirkt.

Bestimmung der biologisch wirksamen Einheit in der Ribosenucleinsäure des Tabakmosaikvirus auf chemischem Wege

The infectious ribonucleic acid of tobacco mosaic virus was desaminated by HNO2 without splitting the nucleotide chain. By hydrolysis of the treated RNA the reaction rate of adenine to hypoxanthine, of guanine to xanthine and of cytosine to uracil was determined. Simultaneously the inactivation of the RNA was measured by bioassay. The desamination of one nucleotide out of 3300 inactivates the whole molecule. Since the RNA of TMV contains 6000 nucleotides more than half of all nucleotides are necessary for the infectivity. It is possible that the alteration of some nucleotides leads to mutation rather than to inactivation.

Die Isolierung eines kristallisierten Peptids aus Tabakmosaikvirus

Das Pro te in des T a b a k m o s a i k v i r u s (TMV) b e s t e h t au s f u n d 2500 Pept idket tenl ) ,~) ,~) , die jeweils Pro l in a m A m i n o ende u n d T h r e o n i n a m Carboxy lende t r agen . E ine solche P e p t i d k e t t e h a t ein Moleku la rgewich t yon 16 bis t 7 000 u n d b e s t e h t au s e twa 150 Aminos~iuren. U m die Reihenfo lge der Aminos~iureres te zu b e s t i m m e n , mul3 das Pep t id in f ibersichtl icher -Weise in kleinere Bruchs t f i cke zer legt werden . Wi r w~ihlten h ie rzu die S p a l t u n g m i t T ryps in , da dieses n a c h den b isher igen E r f a h r u n g e n ~) s t r eng spezif isch w i rk t u n d n u t die P e p t i d b i n d u n g e n angrei f t , an denen die C a r b o x y l g r u p p e n der bas i schen Aminos~iuren bete i l ig t s ind. Da in der P e p t i d k e t t e des T M V 9 Arginin, I Lysin, j edoch kein H i s t i d i n R e s t vork o m m t , s ind im ganzen t 1 Spal ts t i icke zu e rwar ten . E n t s p r e chend den E r w a r t u n g e n w u r d e n n a c h der E i n w i r k u n g des T r y p s i n s auBer d e m bere i t s v o r h a n d e n e n Prol in zehn neue A m i n o e n d g r u p p e n festgestel l t , die als D i n i t r opheny l (DNP)

Untersuchungen über das Virus der atypischen Geflügelpest

Das Virus der atypischen Geflügelpest wurde durch fraktionierte Zentrifugierung oder Fällung mit Ammonsulfat aus der Eiflüssigkeit bebrüteter Hühnereier rein dargestellt. Das isolierte Protein bewirkt noch in einer Menge von 10-14,88 g N eine 50-proz. Letalität der Hühnerembryonen und mit 3,6·10-8gN eine Hämagglutination. Es reagiert nicht mehr mit dem Antiserum gegen normales Eiprotein. gibt aber noch in hoher Verdünnung ein Präzipitat mit virusspezifischem Antiserum. Die immunisierende Wirkung der aus den Viruskonzentraten hergestellten Vaccinen ist im Kückenschutztest um ein Vielfaches höher als das des Ausgangsmaterials. Nach elektronenmikroskopischen Untersuchungen ergibt sich für das Virus in -Wasser eine runde Form, in salzhaltigen Lösungen ein mehr oder weniger gestreckter Faden. Messungen der Sedimentations- und Diffusionskonstanten des Virus in Wasser und Salzlösungen zeigen keine Veränderung des Formfaktors mit der Salzkonzentration. Es wird daher angenommen, daß die elektronenoptisch beobachtete Formwandlung bei der Präparation des Virus auf der Trägerfolie erfolgt. Die Sedimentationskonstante beträgt 1340 S, das Teilchengewicht 800·106. Die auf biologischem Wege für die Träger der Infektiosität und der hämagglutinierenden Wirkung bestimmte Sedimentationskonstante stimmt mit der optisch für das Protein beobachteten überein.

Die Bildung der infektiösen Ribonucleinsäure während der Vermehrung des Tabakmosaikvirus

Young plants of Nicotiana tabacum (Var. Samsun) were infected with tobacco mosaic virus and kept at a constant temperature between 23 and 27°C and at constant illumination. The virus concentration was determined by bioassay on Nicotiana glutinosa. An exponential increase in virus concentration occurred 20-30 hours after infection. This latent period is significantly shorter after infection with virus ribonucleic acid. Probably the nucleic acid has to be liberated from the nucleoprotein before multiplication can start. The formation and multiplication of free virus ribonucleic acid could be demonstrated earlier than the formation of the complete virus. Infectious nucleic acid was measured by direct extraction of the plants with phenol. Nucleic acid included in the virus was determined after degradation of the free ribonucleic acid by incubation at 37°C and subsequent phenol extraction. The amount of free ribonucleic acid reaches a maximum 40 hours after infection and decreases afterwards to the extent as the virus bound ribonucleic acid increases. A general hypothesis for the biosynthesis of tobacco mosaic virus is given.

Untersuchungen über das Tabakmosaikvirus mit fluoreszierenden Antikörpern

Ein Verfahren zur Untersuchung pflanzlicher Gewebe mit Hilfe fluoreszierender Antikörper wird beschrieben. Tabakpflanzen werden in bestimmten Abständen nach der Infektion mit Tabakmosaikvirus untersucht. Virusprotein ist bereits 45 Stdn. nach der Infektion nachweisbar. Es tritt zuerst im Cytoplasma in einer Zone um den Kern herum auf, später breitet es sich über das ganze Cytoplasma aus. In Kernen und Chloroplasten läßt sich kein Virusprotein nachweisen. Die Synthese des Virusproteins scheint demnach ausschließlich im Cytoplasma stattzufinden. Dies wird auch durch Fraktionierungs-Versuche an infiziertem Gewebe bewiesen. Hier ist Virusantigen mit Hilfe fluoreszierender Antikörper vor allem in der Mikrosomen-Fraktion nachweisbar.

Aktomyosin und seine Komponenten, I. Mitt.

1. Es ist möglich, aus Myosinextrakten reines L-Myosin und reine Aktomyosinpräparate zu erhalten, wenn durch eine Ausfällung der gesamten Myosinfraktion zunächst Fremdeiweiße und ATP entfernt werden. Aus der Lösung des Myosinniederschlages fallen dann die Aktomyosine zusammen mit dem Hauptteil der Denaturierungsprodukte zwischen pH 6 und 7 bei einer Ionenstärke ∼ 0,3 µ aus. Aus dem Überstand kann das L-Myosin bei 0,03 µ gefällt werden. 2. Die Denaturierungsprodukte lassen sich dann aus der reinen L-Myosinlösung praktisch vollständig, aus den Aktomyosinlösungen schwerer und nur zum großen Teil mit hoher Tourenzahl abzentrifugieren (15 000 U/min). 3. Die nach diesem Verfahren hergestellten L - Myosinlösungen enthalten nicht mehr Aktomyosinspuren als die „kristallisierten“ L-Myosine von Szent-Györgyi, jedoch keine Denaturierungsprodukte. Dagegen bilden sich bei einer zweimaligen „Kristallisation“ anscheinend immer, bei einer einmaligen häufig, Denaturierungsprodukte, während sie erst nach der 3. oder 4. fraktionierten Umfällung gelegentlich aufzutreten beginnen. 4. Die Ausbeute an L-Myosin ist bei fraktionierter Umfällung sehr viel größer. 5. Außerdem wird - im Gegensatz zum „Kristallisationsverfahren“ - durch die Fraktionierung auch reines natürliches Aktomyosin gewonnen. 6. L-Myosin unterscheidet sich von natürlichem Aktomyosin durch eine etwa 10-mal kleinere Streuung des Lichtes (τ = 0,05 bis 0,14 cm-1 gegenüber 0,4 bis 1,5 cm-1) durch eine ATP-Empfindlichkeit von 0 bis 4% gegenüber 100 bis 200% beim Aktomyosin, durch eine Viskositätszahl je nach dem Gefälle von Zη = 0,14 bis 0,2 gegenüber 0,3 bis 0,5 und durch die Sedimentationskonstante. 7. Sie beträgt für L-Myosin s20(c=0) = 7,1, sie wird größer bei den denaturierten L-Myosinen, wobei die Stufe mit s20(c=0) = 15 bevorzugt zu sein scheint, während sie bei Aktomyosin s20(c=0) nie kleiner ist als ∼ 80. Es gibt nicht ein Aktomyosin, sondern mehrere mit scharf unterschiedenen Sedimentationskonstanten s20(c=0)= 90, s20(c=0)= 280 usw. Aktomyosine mit verschiedenen Sedimentationskonstanten und L-Myosin können nebeneinander in derselben Lösung vorkommen. Aktin und L-Myosin vereinigen sich also nicht in beliebigen Proportionen zu einem jeweils einheitlichen Komplex, wie Szent Györgyi meint. Die Dissoziation des Aktomyosin in L-Myosin und Aktin findet einen charakteristischen Ausdruck in der Veränderung der Sedimentationskonstanten. Dasselbe gilt für die Vereinigung von L-Myosin mit Aktin zu Aktomyosin. Die ATP-Wirkung auf die Dissoziation von Aktomyosin ist durch die Wirkung von Ionenstärke und pH nicht zu ersetzen. Doch bleibt es offen, wieweit diese letzteren Faktoren in sehr langen Zeiten ähnliche Vorgänge einzuleiten vermögen.

Zur Bestimmung der Amino-Endgruppen verschiedener Hämoglobine und des Tabakmosaikvirus mit Phenylisothiocyanat

Die Methoden zur Trennung und Identifizierung der Thiohydantoine wurden verbessert. Zum Nachweis des Thiohydantoins des Glykokolls wurde eine spezifische Farbreaktion gefunden. Versuche an verschiedenen synthetischen Peptiden bestätigten die früheren Befunde, daß Phenylisothiocyanat auch mit nicht-endständigen Glykokollresten reagieren kann. Das Ausmaß der Reaktion ist jedoch nicht so hoch, wie wir früher annahmen. Die Endgruppen der Hämoglobine von Rind, Pferd und Mensch wurden bestimmt. Im Gegensatz zu den Befunden anderer Autoren ergaben sich bei allen nur 4 Endgruppen je Molekül. Die Beimengungen an Thiohydantoinen nicht-endständiger Aminosäuren lagen zwischen 2 und 12 Prozent. Im Tabakmosaikvirus ist keine Amino-Endgruppe nachweisbar. Behandelt man jedoch das Protein mit Trichloressigsäure, so erscheint Prolin als einziger amino-endständiger Rest in Mengen von 2400 Mol. je Mol. TMV. Die Beimengungen anderer Thiohydantoine betragen höchstens 15 Prozent. Eine unspezifische Hydrolyse unter Bildung verschiedener Endgruppen kann daher nur in sehr geringem Umfang stattgefunden haben.

Prolin als Endgruppe des Tabakmosaikvirus

Das nucleinsäurefreie Protein des Tabakmosaikvirus wurde mit Dinitrofluorbenzol umgesetzt und hydrolysiert. Bei vollständiger Hydrolyse ist kein α-Dinitrophenyl-Derivat einer Aminosäure faßbar, sondern im wesentlichen nur Dinitrophenol. Untersuchungen über die Beständigkeit einer Anzahl von Dinitrophenyl-aminosäuren ergaben, daß das Dinitrophenol durch Zersetzung des Dinitrophenyl-prolins entsteht. Der direkte Nachweis der Dinitrophenyl-prolyl-Gruppe gelang durch partielle Hydrolyse. Hierbei entsteht Dinitrophenyl-prolin, das abgetrennt und eindeutig identifiziert werden konnte, und Dinitrophenyl-propyl-peptide. Prolin ist demnach die einzige endständige Aminosäure mit freier α-Aminogruppe im Tabakmosaikvirus. Aus der Menge des erhaltenen Dinitrophenols wurde die Zahl der im Tabakmosaikvirus vorhandenen Peptidketten zu etwa 2300 bestimmt. Sie scheinen alle unter sich gleich zu sein. Die zum Vergleich durchgeführte Endgruppenbestimmung im Pferdehämoglobin bestätigte die Angaben von Sanger und Porter.

Die Adsorptionsanalyse der Aminosäuren

Am Beispiel des β-Lactoglobulins und des Proteins des Tabakmosaikvirus wird gezeigt, daß die Gruppentrennung der Aminosäuren nach Schramm und Primosigh auch bei Eiweißstoffen reproduzierbare Ergebnisse liefert, wenn die richtigen Hydrolysebedingungen eingehalten werden. Die Genauigkeit des Verfahrens liegt bei Anwendung von etwa 10 mg Protein-N bei etwa 2%. Die Analysenergebnisse stimmen mit denen anderer Autoren überein. Das Verfahren ist geeignet, die optimalen Hydrolysebedingungen festzulegen, da sich die Anwesenheit von nicht hydrolysierten Peptiden und von Zersetzungsprodukten der Aminosäuren, die bei zu langer Hydrolyse entstehen, deutlich bemerkbar macht. Die Störungen, die bei der Proteinhydrolyse durch den Zerfall der Aminosäuren eintreten, wurden durch Modellversuche weiter geklärt. Es erscheint notwendig, diese Einflüsse bei allen genaueren Proteinanalysen zu berücksichtigen.