Heidwolf Arnold

Klinische und biochemische Untersuchungen zur Glucosephosphatisomerasc normaler menschlicher Erythrocyten und bei Glucosephosphatisomerase-Mangel

ZusammenfassungBei einem jungen Mann einer deutschen Familie mit einer hereditären hämolytischen Anämie wurde eine Verminderung der Glucosephosphat-Isomerase in den Erythrocyten auf etwa 25% festgestellt. Aus Familien-Untersuchungen geht eine autosomal-rezessive Vererbung des Defektes hervor. In den Thrombocyten fand sich der Defekt im gleichen Ausmaß ohne Störung der Blutgerinnung. In den Leukocyten war die Enzymaktivität auf 73% vermindert. Der Glucose-6-phosphat-Spiegel in den Blutzellen war geringgradig erhöht. Die Glykolyserate gemessen als Lactatbildung war nicht vermindert.Es wurden Versuche unternommen, die Anämie durch Eingriffe in die Regulation des Energiestoffwechsels der Erythrocyten zu bessern. Während die Gabe von Methylenblau keinen Effekt hatte, gelang es durch Infusion von anorganischem Phosphat eine kurzfristige Besserung des Blutbildes zu erzielen.Eine Methode zur 2000fachen Anreicherung des Normalenzyms und 7000fachen Anreicherung des Enzyms des homozygoten Defektträgers wurde ausgearbeitet. Die Eigenschaften der angereicherten Enzyme wurden miteinander verglichen. Das pH-Optimum beider Enzyme und die Michaelis-Konstanten für Fructose-6-phosphat unterschieden sich nicht. Das Molekulargewicht beider Enzyme wurde mit Hilfe der Gel-Chromatographie zu 92000 bestimmt. Die Hitzestabilität des gereinigten Defektenzyms war deutlich vermindert. Zusammen mit dem abweichenden elektrophoretischen Verhalten ergibt sich daraus, daß bei unserem Patienten nicht nur eine quantitative, sondern auch eine qualitative Veränderung der Glucosephosphat-Isomerase vorliegt.SummaryIn a young man from a German family with a hereditary nonspherocytic hemolytic anemia the erythrocyte glucose phosphate isomerase was decreased to 25%. Family studies revealed an enzyme deficiency of about 50% in both parents and of 23% in a brother with the same hemolytic disorder. All heterozygotes were clinically unaffected. An autosomal-recessive mode of inheritance is considered. The enzyme activity in leukocytes was 73% and in thrombocytes 27%. Blood clotting was normal.The glucose-6-phosphate level in the circulating red blood cells was elevated to 37.9±1.9 nM/ml cells (normal range 9–33). The glycolysis of the leukocyte free red cells measured as lactate formation was not decreased. Furthermore no difference between the patients cells and normal cells with the same reticulocytosis was noted when glycolysis was stimulated by phosphate.Attempts were made to improve the anemia by intervening in the regulation of energy metabolism of the red blood cells. When giving methylenblue no effect was observed, but by intravenous infusions of inorganic phosphate a short dated recovery of the red blood count was evident.From normal leukocyte free red cells the enzyme was purified 2,000 fold, from the patients cells 7,000 fold. The purified enzymes were compared. No difference in the pH optima and the Km values could be observed. The molecular weight of the normal and the patients enzyme as determined by gel chromatography was 92,000 in both cases. Heat stability of the patients enzyme at 45° C was markedly diminished. Thus in connection with the abnormal electrophoretic mobility the patients glucose phosphate isomerase is not only diminished but also present in a modified state.

Hereditary deficiency of glucosephosphate isomerase as a cause of nonspherocytic hemolytic anemia

SummaryThe molecular heterogeneity of GPI deficiency is demonstrated. All variants studied are different from each other. The clinical picture is characterized by nonspherocytic hemolytic anemia.ZusammenfassungDie molekulare Heterogenität des Glucosephosphat-Isomerase-Mangels wird beschrieben. Alle untersuchten Varianten sind voneinander verschieden. Das klinische Bild ist durch eine nichtsphärozytäre hämolytische Anämie gekennzeichnet.

Zur Formalgenetik der Phosphoglucoseisomerase (EC: 5.3.1.9)

SummaryIn a family two children exhibited a non-sphaerocytic hemolytic anemia; they revealed the homozygous phenotype PGI9. The parents are heterozygous PGI 9-1. The comparison of the zymogram pattern of both parents and children allows the conclusion that the PGI molecule is a dimer which has identical subunits in homozygous individuals.ZusammenfassungEs werden Befunde aus einer Sippe mit PGI-Defizienz mitgeteilt. Die beiden Patienten haben eine nichtsphärocytäre hämolytische Anämie, sie besitzen den homozygoten Phänotypus PGI9. Die Eltern sind heterozygot PGI 9-1. Der Zymogrammvergleich von Eltern und Kindern spricht für die Hypothese, daß die PGI ein dimeres Molekül sei, das normalerweise aus identischen Polypeptidketten aufgebaut ist.

[Glucose phosphate isomerase type Recklinghausen: a new enzyme variant with haemolytic anaemia (author's transl)].

SummaryHereditary deficiency of glucose phosphate isomerase (GPI) was observed in a 9-year old gire of German origin. Residual enzyme activity in red cells was 15%, in platelets 33%, and in leukocytes 35%. The patient is suffering from severe non-spherocytic haemolytic anaemia. Splenectomy did not bring about a remarkable clinical improvement.Physico-chemical studies of the deficient enzyme showed a significantly decreased thermostability with a biphasic inactivation curve. Starch gel electrophoresis revealed only one zone of activity; the migration was 88% compared to the normal main zone. The isoelectric point was decreased (pH 9,60), determined by gel chromatography the molecular weight was within the normal range (92 000). The defect enzyme was purified from red cells 30 000-fold with a yield of 26%. The kinetic properties (Km for G-6-P, Km for F-6-P, Vmax of foreward and backward reaction, pH optimum of the foreward and backward reaction, inhibitor constants for 2.3-DPG and 6-PG of the foreward and backward reaction) were similar to those of the normal enzyme.Metabolic studies demonstrated a markedly increased G-6-P concentration of the erythrocytes (90 nMol/ml RBC); ATP was slightly elevated. Lactate production from glucose was increased when compared to normal RBC and was in the normal range when compared to RBC samples with comparable content of reticulocytes.Aging of the deficient RBC was simulated in vitro. The activity of the defect enzyme decreased slightly faster within the patients red cells than within normal RBC during the experiment. By the 5th day of aging lactate production was only 47% compared to control cells. Simultaneously, haemolysis of 15% was observed in the deficient cells compared to only 8% in the control cell suspension. Using mannose as a source of energy bypassing the metabolic block, the rate of lactate production was still normal at the 5th day of the aging period which reflects the cause and effect relationship between impairment of energy metabolism and GPI deficiency.ZusammenfassungBei einem 9jährigen Mädchen deutscher Abstammung fand sich eine hereditäre Glucosephosphat-Isomerase-Defizienz. Die Restaktivität in den Erythrocyten war 15%, in den Thrombocyten 33% und in Leukocyten 35%. Physikalisch-chemische Untersuchungen des defekten Enzyms ergaben eine stark verminderte Thermostabilität mit einer biphasischen Inaktivierungskurve. Bei der Stärkegelelektrophorese fand sich eine Bande mit einer Wanderungsgeschwindigkeit von 88% im Vergleich zur normalen Hauptbande; der isoelektrische Punkt war auf pH 9,60 erniedrigt. Das gelchromatographisch bestimmte Molekulargewicht war mit 92 000 im Normbereich. Das defekte Enzym wurde aus den Erythrocyten der Patientin mit einer Ausbeute von 26% 30 000fach angereichert. Die kinetischen Eigenschaften (Km für G-6-P, Km für F-6-P, Vmax der Vor- und Rückreaktion, pH Optimum der Vor- und Rückreaktion, sowie die Inhibitorkonstante für 2,3-DPG der Rückreaktion und die Ki für 6-PG der Vorund Rückreaktion) wichen nur unwesentlich vom Verhalten des Normalenzyms ab. Stoffwechseluntersuchungen ergaben eine Erhöhung von G-6-P auf 90 nMol/ml Erythrocyten der Patientin. ATP war leicht erhöht. Die Lactatbildung der defizienten Erythrocyten war im Vergleich zu einer Normalzell-population gesteigert und im Vergleich zu einer reticulocytenreichen Kontrolle normal.Eine Alterung der Patientenerythrocyten in vitro ergab eine leicht beschleunigte Inaktivierung der defekten GPI in den Zellen. Die Lactatbildung sank am 5. Tag der Alterung bei Verwendung von Glucose als Energiequelle auf 47% der Kontrollzellen ab. Gleichzeitig war die Hämolyse doppelt so hoch wie bei den Kontrollzellen. Bei Verwendung von Mannose als Energiequelle, wobei der Enzymblock umgangen wird, war am 5. Tag die Lactatbildung nicht eingeschränkt. Daraus ergibt sich die Bedeutung des GPI-Defektes für die Stoffwechsel-beeinträchtigung der Erythrocyten und die Verkürzung ihrer Lebenszeit.

Zur Frage gewebespezifischer Isoenzyme der Glucosephosphatisomerase des Menschen

SummaryThe occurrence of tissue-specific isoenzymes is important for the distribution of the disease in enzyme deficiencies. In the case of GPI our results of starch gel electrophoresis, substrate affinity measurements and thermoinactivation gave no evidence for the occurrence of tissue-specific isoenzymes of GPI in man. GPI activity was in the same order of magnitude in various postmortal and intravital samples of human tissues, except in erythrocytes.ZusammenfassungBei angeborenen Enzymdefekten ist das Vorhandensein von organspezifischen Isoenzymen des betreffenden Enzyms wichtig für die Ausbreitung der Funktionsstörung im Organismus. Die Ergebnisse der Elektrophorese, der Bestimmung der Substrataffinität und der Thermoinaktivierung der GPI in menschlichen Organextrakten lieferten keinen Anhaltspunkt für ein organspezifisches Isoenzymsystem. Die Verteilung der GPI-Aktivität in verschiedenen postmortal und intravital entnommenen Gewebsproben ist relativ gleichförmig mit Ausnahme der Erythrocyten.

The polymorphism of nucleosid effect in pyruvate kinase deficiency

The heterogeneity of pyruvate kinase (PK) deficiency (residual enzyme activity of erythrocyte PK in type A 0--40%, in type B 50--70%), described formerly as genetically determined variability, is additionally confirmed by different allosterie behaviour in fructose-l,6-diphosphate (FDP) activation. PK was purified 2.500-fold (recovery 50%) from isolated leukocyte-free red blood cells by Sephadex filtration, precipitation with ammonium sulfate, and heat denaturation. By subsequent ammonium sulfate precipitations (saturation of 20--38%, 38--45%, and 45--70%) three fractions of P K were purified, which showed different mobility in cellulose acetate high voltage eleetrophoresis. Kinetic properties with the ligands phosphoenolpyruvate (PEP), adenosine diphosphate (ADP) and FDP were studied in PK deficiency type A and ]3 and in P K from normal subjects. HILL-plots illustrate the number of binding sites and the dependence of P K reaction velocity on the concentrations of the effeetors. HILL-exponents (nit) are calculated from the equation: v

Hemolytic anemia with pyruvate kinase deficiency presenting as paravertebral myelolipoma

SummaryThe case of a patient with erythrocyte pyruvate kinase (PK) deficiency hemolytic anemia leading to extramedullary hematopoiesis in a paravertebral myelolipoma is presented.

High levels of brain-type creatine kinase activity in human platelets and leukocytes: a genetic anomaly with autosomal dominant inheritance.

The ectopic expression in peripheral blood cells of the brain-type creatine kinase (CKB) is an autosomal dominant inherited anomaly named CKBE (MIM ID 123270). Here, we characterized the CK activity in serum, platelets (PLT) and leukocytes (WBC) of 22 probands (from 8 unrelated families) and 10 controls. CK activity was measured by standard UV-photometry. Expression of the CKB gene was analyzed by real-time PCR and Western blotting. DNA sequencing including bisulfite treatment was used for molecular analysis of the CKB gene. Serum CK levels were comparable between probands and controls. CKBE probands revealed significantly higher CK activity in PLT (3.7 ± 2.7 versus 179.2 ± 83.0 U/10(12) PLT; p<0.001) and WBC (0.4 ± 0.3 versus 2.6 ± 2.1 U/10(9) WBC; p=0.004). Inhibitory anti-CKM antibodies did not affect CK activity indicating that the CK activity is generated exclusively by the CK-BB isoenzyme. CKB mRNA and protein levels were significantly higher in PLT and WBC from probands compared to controls. Re-sequencing of the entire CKB gene and methylation analysis of a CpG island revealed no alteration in CKBE probands. The genetic basis of CKBE remains unclear, however, we propose that a de-methylated CKB gene is inherited that leads to high CKB expression levels in myeloic precursor cells in the bone marrow.

Augsburg-type glucosephosphate isomerase deficiency

SummaryIn a 1-year-old German boy a GPI deficiency was found to be the cause of a chronic nonspherocytic hemolytic anemia with recurrent hemolytic crises. Because of consanguinity of the parents, the patient is true homozygote. The investigation of the biochemical properties of the deficient enzyme revealed an altered electrophoretic behavior, pronounced thermolability, an increased affinity for G6P, an increased affinity for the competitive inhibitor 6-PG, and slightly changed pH optima for both substrates. Electrophoresis after freezing and thawing the hemolysate indicates that the genetic modification of the subunit involves the mechanism of transforming the main band into the secondary bands. The properties of the new deficient GPI indicate a new variant designated GPI Augsburg.ZusammenfassungBei einem einjährigen deutschen Jungen wurde als Ursache für eine chronische hämolytische Anämie mit rezidivierenden hämolytischen Krisen ein GPI-Defekt der Erythrozyten entdeckt. Bei Konsanguinität der Eltern handelt es sich um einen homozygoten Defektträger. Die Untersuchung der biochemischen Eigenschaften des Defektenzymes ergab ein verändertes elektrophoretisches Muster, eine deutliche Thermolabilität, eine erhöhte Affinität für G6P und für den kompetitiven Inhibitor 6-PG und leicht zum alkalischen verschobene pH-Optima für beide Substrate.Von der Elektrophorese nach Einfrieren und Auftauen des Hämolysates kann geschlossen werden, daß die genetische Modifikation der GPI-Untereinheit hauptsächlich den Mechanismus betrifft, der beim normalen Enzym die Hauptbande in die Sekundärbanden überführt. Die einmaligen Eigenschaften des Defektenzyms sprechen für eine neue Variante, für die nach dem Geburtsort des Patienten der Name GPI Augsburg vorgeschlagen wird.

Immunological studies on glucosephosphate isomerase deficiency: Instability and impaired synthesis of the defective enzyme

ZusammenfassungMit immunologischen Methoden wurde der Gehalt an GPI-Protein in normalen und defizienten roten Blutzellen untersucht. In normalen Zellen ist nahezu sämtliches Enzymprotein auch katalytisch aktiv. Bei den vier untersuchten genetischen Varianten mit nicht-sphärocytärer hämolytischer Anämie fand sich in allen Fällen eine Verminderung an GPI-Protein in unterschiedlichem Ausmaß. Ebenfalls unterschiedlich war der Anteil des katalytisch aktiven Proteins. Es wird geschlossen, daß bei der Pathogenese des Enzymdefekts sowohl eine erhöhte Labilität des Enzyms als auch eine verminderte Synthese eine Rolle spielt.SummaryThe content of GPI protein in normal and GPI deficient red cells was studied by immunological methods. In normal cells almost all enzyme protein is catalytically active. In the four inherited variants with non-spherocytic hemolytic anemia studied the content of GPI protein was decreased to a variable degree. Furthermore, the catalytically active portion of GPI protein varied markedly. It can be concluded that in the pathogenesis of this hereditary disorder an increased lability as well as an impaired synthesis of the defective enzyme play a role.