Hideyuki Kawakami

Distribution and Characterization of Hemolytic, and Enteropathogenic Motile Aeromonas in Aquatic Environment

A year-long survey on the distribution of motile Aeromonas species in the surface waters of riverine and marine environments was conducted. The filtered membranes were directly placed onto the modified Pril-xylose-ampicillin agar for the enumeration of Aeromonas species. High counts of motile aromonads were found in riverine stations and this bacterial population was also observed in significant quantities in polluted marine samples. In the identification of 2,444 isolates, three species of motile Aeromonas were observed. A. caviae (43%) was prevalent followed by A. sobria (35%) and A. hydrophila (20%). A. hydrophila was high in clean riverine samples, A. sobria was predominantly isolated from a stagnant water sampling area, and A. caviae was distributed more in marine samples. Statistical analyses suggested that the densities of Aeromonas were related to the cumulative effect of various physicochemical parameters rather than to a single factor. Among the species of Aeromonas, A. hydrophila, and A. sobria were highly hemolytic whereas only 11% of A. caviae were observed to lyse sheep erythrocytes. Suckling-mouse assay was performed to elucidate the enterotoxicity of motile aeromonads and 21% of the tested strains (one A. caviae strain) were found to produce enterotoxin.

Seasonal Distribution of Vibrio parahaemolyticus Serotypes Along the Oyster Beds in Hiroshima Coast

1988年4月から、1989年3月までの1年間にわたって、広島県沿岸部のカキ養殖海域5地点から表層水、セジメントおよびカキ(冬季間のみ)を採取し、腸炎ビブリオの季節分布を調べ、分離菌の血清型別を行った。さらに物理的化学的各種困子の影響と汚染指標菌との関係についても検討した。腸炎ビブリオは夏季にはすべての地点で多数検出された。しかし、冬季になるに従って減少し、1～3月には検出されなくなった。腸炎ビブリオの出現と菌数は河口域地点で多く、出現する血清型も多かった.分離菌317株のうち、53.9%は型別可能で41の血清型に分類されたが、残りは型別できなかった。分離株を同定の結果、地点によって常時出現する血清型とセジメントやカキからのみ分離されて、同地点の海水から出現しないような血清型もみられた。分離した腸炎ビブリオ株はすべて神奈川現象陰性株であった。しかし、陰性株の中にも病原性を示すものがあるとの報告がみられることから、カキ養殖場における腸炎ビブリオの検査は重要である。

A retroelement in Vibrio cholerae

Cholera is an epidemic diarrhoeal disease caused by the Gram-negative bacterium Vibrio cholerae (Faruque et al., 1998, J Microbiol Mol Biol Rev 62: 1301±1314). Until recently, only the O1 serotype of V. cholerae has been believed to cause epidemic cholera. However, one of the non-O1 serotypes, O139, is now shown to cause epidemic cholera, and it is suggested that this serotype originates from the O1 serotype. We investigated whether Vibrio cholerae contains a retroelement, called retron, which is responsible for production of a unique RNA±DNA complex, multicopy singlestranded DNA (msDNA) (Inouye and Inouye, 1993, Curr Opin Genet Dev 3: 713±718). The retron is a genetic element consisting of ret, the gene for bacterial reverse transcriptase (RT), msr, a coding region for the RNA part of msDNA, and msd, a coding region for the DNA part of msDNA. Although the function of RT and msDNA remains elusive, the overproduction of msDNA has been shown to impair the DNA mismatch repair system by sequestration of MutS function resulting in a high frequency of mutations in a genome (Maas et al., 1996, Mol Microbiol 19: 505± 509; Mao et al., 1996, FEMS Microbiol Lett 144: 109± 115). We found that some Vibrio spp., such as V. cholerae O139, V. parahaemolyticus and V. mimicus contain msDNA (unpublished data). The msDNA from V. cholerae O139 was isolated and its DNA sequence, determined using the method of Maxam and Gilbert, indicates that it has a typical msDNA structure consisting of a stable stem-loop structure (not shown). Subsequently, we examined a partial genomic sequence of V. cholerae O1 (biotype El Tor, strain N16961) carried out by the Institute of Genomic Research and found that the bacterial genome contains a sequence completely matching the msDNA sequence from V. cholerae O139. Furthermore, the sequence for msDNA is followed by three open reading frames (ORFs) (Fig. 1A). The ®rst ORF is homologous to all bacterial RTs found to date (Fig. 1B). Inverted repeat sequences (a1-a2 sequences), which are essential for msDNA synthesis are also identi®ed. The length of the DNA part of msDNA is predicted to be 95 bases (Fig. 1C). Thus the retron, the msDNA and RT from V. cholerae O1 are termed as retron-Vc95, msDNA-Vc95 and RT-Vc95 respectively. The msDNA-Vc95 has sequence similarity to msDNA-Ec78 from enteropathogenic Escherichia coli (Lima and Lim, 1997, Plasmid 38: 25±33), and has one mismatched basepair in its secondary structure. RT-Vc95 has the highest similarity with RT-Ec83 (47% identity) (Lim, 1992, Mol Microbiol 6: 3531±3542) and RT-Ec78 (47% identity) (Lima and Lim, 1997, Plasmid 38: 25±33), both from pathogenic E. coli. The second ORF is similar to the second ORF of retron-Ec83, which is a presumed ATP-binding protein. The function of the third ORF is unknown. The present ®ndings suggest a genetic relationship between V. cholerae and pathogenic E. coli. LeClerc et al. reported that, in pathogenic E. coli and Salmonella, there are a large number of populations of hypermutable strains due to a defective mismatch repair system (LeClerc et al., 1996, Science 273: 1208±1211). It would be interesting to examine whether this phenotype is correlated to the ability of msDNA production in these strains. Although the toxin genes ctxABr of V. cholerae are parts of the lysogenized genome of CTXF ®lamentous bacteriophage, and V. cholerae produces the infectious CTXF phage particles (Waldor and Mekalaros, 1996, Science 272: 1910±1914), retron-Vc95 does not seem to be linked to the CTXF genome, as judged from the sequence data.

Respiration-driven amino acid uptake system in Pseudomonads

Pseudomonas putidaにおいてアミノ酸の取り込みを[H+]の濃度変化を追跡して調べた。その結果、酸素呼吸によりて駆動されるグルタミン酸の取り込みが観察された。このシステムはプロトンコンダクターであるCarbonyl cyanide m-chloropheny hydrazoneによっては阻害されず,CN-によって阻害された。これらのことから,本細菌には第一次能動輸送として呼吸によって駆動されるグルタミン酸の取り込みシステムがあることが推測された。

Microbiological Aspects and Recovery of Salmonella in Retailed Food

1年間にわたって小売店から購入した148例の生肉および水産食品について微生物学的な品質測定を行った結果、鶏肉を除いて一般に良好であった。また、鶏肉の半数以上がサルモネラ(4血清型)陽性であった。しかも、同じ店から同じ血清型のサルモネラが繰り返して分離されたことから、2次汚染が推定された。サルモネラと糞便大腸菌、あるいは糞便レンサ球菌の出現との間には関係が無いように見える。しかしながら、サルモネラ陽性例の59%は糞便大腸菌のMPNが10^4/100g以上であった。つぎに、われわれの研究室で分離、保存していた50株のサルモネラ(26血清型)について、6種類(NA、TC、CP、KM、CL、ABP)の抗生物質耐性試験を行った結果、半数以上が耐性を示した。中でもColistin(30μg)耐性を示す血清型のものが、もっとも多かった。S. paratyphi Bは5剤耐性であり、また、食品から分離したサルモネラはすべて多剤耐性を示した。

Hg2+存在下におけるHg2+耐性菌の挙動

Hg2+によって細菌の受ける影響を調べるため下水から分離したHg2+耐性能の高いPseudomonas(No.10&19)を用いて増殖に対する熱力学的解析と形態学的観察を行なった。その結果、12.5μg/mlのHg2+存在下での増殖はHg2+が存在しない場合に比べて誘導期が短縮された。この時の増殖に要する活性化エネルギーは、No.10株が2.5Kcal、No.19株が5.0Kcalと両菌株とも最低となった。一方、形態学的には、Hg2+(12.5μg/ml)存在下で、本来の形態と運動性を保持するが、逆にHg2+が存在しないと変異しやすくなり、細胞が伸長することが判った。これは細胞壁や隔壁の生合成が阻害されるために起るものと推察された。以上の結果から、今回分離したMIC100の高い耐性能を有するHg2+耐性菌にとってHg2+は増殖を促進させると共に細胞を安定な状態に保持する効果をもつことが示唆された。

瀬戸内海沿岸海域における細菌叢 : II.福山湾における従属栄養細菌の特質と物理-化学的要因

瀬戸内海沿岸海域における従属栄養細菌の菌叢を調べ、これらが光合成を営むプランクトンの量とどのような関係にあるかを検討した。その結果を以下にまとめる。1. プランクトンの量を示すクロロフィールa量は水温が20℃～26℃の時に多く、しかもCODや全リン濃度と比例関係にあった。2. 細菌学的には、これら物理-化学的要因とは関係なく、一般菌数は全体を通じて10⁴～10⁶MPNレベルを維持し、そのほぼ100%が硝酸塩還元能およびゼラチン液化能を有していた。3. このような状況にある海域での細菌叢を調べると、比較的清澄な海域、汚濁の進んでいると思われる海域のどちらにも優勢的に存在するVibrioを除いて検討してみると、全体を通じてPseudomonasとFlavobacteriumが、属レベルまで分類することができたグラム陰性桿菌のうちのほぼ50%以上を占めていた。一方、汚濁の進んだ海域で多く検出されているAlcaligenes、Moraxella-Acinetobacter、 それにEnterobacteriaceaeに属するものは少く、合わせて50%を越えたのはStation 1で2回、 Staion 2で2回 Station 3で6回であった。4. 以上の結果から、 光合成を営むことのできるプランクトンの量はCODや全リン濃度、pH、水温といった環境要因に大体比例していたが、同じ海域に分布する細菌叢は、その数、種類ともに、これらとは比例せず、またプランクトン量の増減とも関連した変化は示さなかった。

瀬戸内海沿岸海域における細菌叢 : I. 福山湾における各種汚染指標菌数と有機汚濁の関係

瀬戸内海の水質を評価するために、そこに分布している微生物叢、特に細菌叢の動静を知る必要があると考え、従属栄養細菌全体に注目して、その動静を調ペることを試みた。今回はその第1段階として、福山市沿岸海域に3定点を設けて、一般細菌数を調べ、CODとの関係を検討した。その結果を以下に要約する。1.CODは赤潮発生時を除くと、1.1～7.8ppmと8ppm以下であった。2.pHは全体を通じて7.8～8.5の範囲にあった。3.これらの結果から、赤潮発生という、異常な時を除けば、各採水地点の海水はpH7.8以上8.3以下、COD8ppm以下という環境保全の基準にほぼあてはまっていた。4.CODを季節別にみると、5月～6月に1.9～18.6ppmと高く、7～8月の夏季には3.4ppm以下と逆に低かった。5.一方、細菌学的な面から検討すると.一般細菌数は10⁴～10⁶ と大体一定のレベルにあったが、汚染指標菌数は変動が大きく、特に大腸菌数は0～1.1×10⁴と大きかった。6.CODが3.4ppm以下と低い夏季でも、一般細菌数は10⁵、大腸菌群数は10³～10⁴と高いレベルを維持している。7.CODと細歯数との間には、特に比例関係はみとめられなかった。8.以上の結果から.瀬戸内海に流入する各種汚染物質の濃度に関係なく、一般細菌や汚染指標菌は常にあるレベル以上の量が存在しており、水質評価に物理的-化学的要因の外に、細菌学的な面からの検討を加える必要があることが示唆された。

海水のサルモネラ汚染ならびに汚染指標菌に関する研究 : II. 無菌海水中におけるサルモネラの消長

海域に流入したサルモネラが,どのような挙動を示すか,その動態を追究する目的で自然海水および無菌海水中でのモデル実験を行なった。 1: 自然海水中では接種したサルモネラは10℃>20℃>30℃の順に生残性を示した。 2: 無菌海水中ではサルモネラの生残性は自然海水中におけるよりも低く,しかもはっきりとした温度依存性を示さなかった。 3: 少量(<10/mlのサルモネラを接種した場合には,菌接種後,一度菌数が減少し,その後次第に増加した。 4: その場合,20℃および30℃に保持するとS.thompson単独例よりもE.coliとの混合例の方がS.thompsonの増殖する割合は低かった。 5: 海水中でのサルモネラの生残性は水温にかなり影響されることが示唆された。

海水のサルモネラ汚染ならびに汚染指標菌に関する研究 : I. 海水中のサルモネラと汚染指標菌の分布

瀬戸内海の環境汚染調査の一環として1972年6月から1974年3月にわたり,福山市沿岸海水を対象にサルモネラと汚染指標菌の動態について調査した。その結果,以下のような成績が得られた。 1. 8地点(A～H)から採取した海水のサルモネラ陽性率は,平均12.1%(28/232)であった。 2. サルモネラ陽性率は地点および季節によって異なり,A地点23.9%(11/46),B地点21.7%(10/46)およびE地点25%(3/12)と陽性率が高く,また季節別では5～10月に高かった。 3. サルモネラ陽性率は港内から港外および沖合部に行くに従って低下した。 4. 分離された42株のサルモネラの菌型またはO群は,S.typhimurium, S.thompson, S.anatum, S.infantis, S.give, S.schleissheim, S.schwarzengrund, S.derby, S,montevideo, S.meleagridis, S,binza, S.senftenbergおよび型別不能のO群B,C1,D,E1であった。 5. これらの菌型・群は,以前に著者らが当地方の飼料工場や河川から分離した菌型と大多数は同じであったことから,陸上環境を汚染しているサルモネラが最終的には海水まで汚染していることが明らかとなった。 6. 従って海水のサルモネラ汚染は水産物のサルモネラ汚染にも影響を及ぼしている。 7. 汚染指標菌は大腸菌群,大腸菌および腸球菌の順で菌数ならびに検出率が高く,大腸菌群はほとんどが陽性であったが,他の2者では陰性例も多かった。 8. これら汚染指標菌の菌数が多い海水ほど,サルモネラ検出率が高い傾向にあった。 9. サルモネラならびに汚染指標菌の検出状況と海水温との関係を検討した結果,サルモネラは汚染指標菌の菌数が多く,しかも,水温が19℃以上の海水から検出される傾向があった。