J. Janke

Die Inkorporation von markiertem Sauerstoff aus Wasser in die ATP-, Kreatinphosphat- und Orthophosphat-Fraktion intakter Muskeln bei Ruhe, tetanischer Reizung und Erholung

Der S~offwechsel der energiereichen Phospha t e in contrac~ilen Gewebe~ u n d die spezielle Verkni ipfung mi~ den mechanischen l~eak~ionen is t nach wie vor ein ungekl~r tes P rob l e m der Muskelphysiologie . Die For schungen der le tz ten 15 J a h r e h a b e n zwar zahlreiche EffekT~e yon A T P an isol ier ten Muskelpro~einen, Ac tomyos in f~den oder Glycerin-Wasser-ex~rahierl~en Muskelfasern gebracht~. A m lebenden Muskel war jedoch auch mi~ moder~er pap ie rch romatograph i sche r Techn ik ke in direk~er Anha lbspunk t fiir eine obliga~orische K o p p e l u n g zwischen der Spal~ung yon A T P zu A D P u n d dem mechanische~ A k t der Kon t rak~ ion zu gewinnen [F~]~cK]~s~w~ u. J ~ K ~ (1953); F~]~CK~VSTEII~, JANKE, DAVIES u. Kt~EBS (1954); F~]~O~]~ST]~I~, J ~ : w , L]~c~~ ] ~ u. B ~ v ~ (1954) ; F ~ n C K ] ~ S ~ ] ~ , JANKE, KI~USE U. LECHNEI~ (1955) ;

Die Bestimmung der absoluten Umsetzungsraten von ATP, Kreatinphosphat und Orthophosphat in der ruhenden Skeletmuskulatur mit Hilfe von H2O18 als Tracer

Abstract1. Using H2O18 as tracer, absolute values of turnover rates of ATP, creatine phosphate and orthophosphate have been determined for isolated frog muscles (M. rectus abdomn.). The very short diffusion time for water leads to almost ideal constancy in supply of tracer in the intracellular volume.2. The quantitative determination of the stable oxygen isotope in intracellular phosphate compounds was effected using proton activation analysis.3. The biological half-life of ATP-Pγ (and creatine phosphate) in the isolated frog muscle is 11.5 min at 20°C, and that of ATP-Pβ is 115 min. The extracted fraction of orthophosphate has a half-life at 20°C of 2.7 min.4. The expected saturation value of 4 labelled O-atoms is not attained in the extracted PO4-fraction. It may be inferred that in the skeletal muscle the “true” orthophosphate fraction, namely that in exchange with ATP, is appreciably overestimated.

Steigerung der absoluten ATP-Umsetzungsrate in der isolierten Skeletmuskulatur unter dem Einfluß von 2,4-Dinitrophenol

Summary1.After a 15 min treatment at 20°C with 5 · 10−4 M 2,4-dinitrophenol (DNP) the creatine phosphate (CP) content of the isolated frog muscle (M. rectus abdomn.) is reduced by 70–80% of the normal. The ATP-fraction displays no significant diminution in concentration after this period of DNP-poisoning.2.The elevated level of intracellular orthophosphate (Pi) (resulting from CP-breakdown) reduces the P32O4-uptake from the extracellular volume. The observed blocking effect of DNP on P32-incorporation in the terminal phosphoryl group of ATP (ATP-Pγ) is due to a deficiency in intracellular tracer-Pi (P32O4) and is not to be interpreted as general inhibition of ATP-synthesis. Use of H2O18 eliminates the disturbing influence of the transmembrane orthophosphate gradient.3.The short diffusion time for water leads to almost ideal constancy in supply of tracer-Pi (PO418) (by H2O18 ⇋ PO4 exchange) to the intracellular volume. Under this steady-state condition it was found that DNP a) intensifies the O18-labelling of the Pi-fraction (by enhancement of dephosphorylations) and b) causes a marked increase in the O18-incorporation in the total ATP-fraction (by enhancement of synthesis). It is noteworthy that the enhancement of O18-incorporation in CP by DNP is much less than that in ATP-Pγ. The resulting difference in O18-labelling between these two phosphoryl groups seems to be a characteristic DNP effect in muscle.4.The absolute turnover rates were calculated using a simple kinetic model20, 26 which takes the ATP-independent H2O ⇋ PO4 exchange into account. The biological half-life of ATP-Pγ in the DNP-treated frog muscle is 69 sec at 20°C, that of ATP-Pβ is 256 sec and that of CP is 130 sec. The Pi-fraction has a half-life at 20°C of 45 sec. Hence in the presence of DNP the turnover rate of ATP-Pγ is 10 times and that of ATP-Pβ is 27 times faster than in the control muscle devoid of DNP (see reference20). The results are discussed in relation to known DNP effects (ATPase activation, uncoupling, inhibition of the Pasteur-effect) in other biological systems.

Die Aufteilung des intracellulären ADP, ATP und Orthophosphats in der ruhenden und tetanisch gereizten Froschmuskulatur mittels einer fraktionierten Extraktion

SummaryBy means of a fractionated extraction method (1.–3. extraction with ethanol, 4. extraction with perchloric acid) the intracellular ADP and orthophosphate of the isolated frog muscle (M. rectus abdomn.) can be separated into two distinct components with different solubility and speed of 32P labelling. In the resting muscle the concentration of the ethanol-insoluble ADP amounts to 0.28 μM/g (=45–50% of the total intracellular ADP determined by direct perchlorid acid extraction). Furthermore there are 0.27 μM/g orthophosphate (=8% of the total orthophosphate) which are ethanol-insoluble. Apart from acid denaturation these ethanol-insoluble ADP and orthophosphate components become removable to about 80% of their total quantities after a 10 min treatment of the muscle powder with 0.7% deoxycholate.After one hour 32P exposure the relative specific activity of the ethanol-insoluble ADP reaches only 1/7–1/8 of the relative specific activity found in the ethanol-soluble ADP. Measurements on ATP-Pβ activity show that ethanol-insoluble ADP exchange with ATP does not take place. Consequently only the ethanol-soluble ADP (whose 32P activity is identical to that of ATP-Pβ) may be used to form the ATP/ADP quotient. Hence in the resting muscle the ATP/ADP quotient increases to a value of 9–10. The difference in 32P labelling between the ethanol-soluble and ethanol-insoluble orthophosphate components amounts to a factor 3. In the tetanic stimulated muscle there are no changes either in concentration or in 32P activity with respect to the ethanol-insoluble ADP and orthophosphate. All changes are related to the corresponding ethanol-soluble components. During 60 sec tetanic stimulation the difference in 32P labelling between the ethanol-soluble and ethanol-insoluble ADP increases by a factor 2 in comparison with the resting muscle. On the other hand the 32P activity of the ethanol-soluble orthophosphate decreases during contraction by a factor 3, that is, nearly the level of ATP-Pγ in the resting muscle. This finding can be explained by the splitting of high-energy phosphate compounds leading to a dilution of the ethanol-soluble orthophosphate component with less labelled molecules. The decrease in 32P activity of the ethanol-soluble orthophosphate is an explanation for the fact that in stimulated muscles, using 32P as tracer — in contrast to the H218O method [2] — no increase of ATP-Pγ turnover is observed.The results are discussed in respect to problems which take into account the compartmentalization of the ethanol-insoluble ADP and orthophosphate as well as their significance for the mechanism of muscle contraction.ZusammenfassungMit Hilfe einer fraktionierten Extraktion (1.–3. Extraktion mit Äthanol, 4. Extraktion mit Perchlorsäure) läßt sich das intracelluläre ADP und Orthophosphat des isolierten Froschrectus in jeweils 2 Komponenten mit unterschiedlicher Löslichkeit und Markierungsgeschwindigkeit aufteilen. Im ruhenden Muskel beträgt die Konzentration des Äthanol-unlöslichen ADP 0,28 μM/g (=45–50% der direkt mit Perchlorsäure extrahierbaren Gesamtfraktion). Von der gesamten Orthophosphat-Fraktion sind unter Ruhebedingungen 0,27 μM/g (=8%) Äthanol-unlöslich. Die Äthanol-unlöslichen Phosphat-Komponenten konnten — unter Umgehung der Säuredenaturierung — mit einer Fermentaktiven wäßrigen Lösung von Deoxycholat zu über 80% aus der Muskulatur herausgelöst werden.Die relative spezifische Aktivität des Äthanol-unlöslichen ADP ist nach 60 min Exposition im ruhenden Muskel um einen Faktor 7–8 geringer als die relative spezifische Aktivität des Äthanol-löslichen ADP. Aufgrund der relativen spezifischen Aktivität von ATP-Pβ konnte ausgeschlossen werden, daß das Äthanol-unlösliche ADP mit ATP im Austausch steht. Infolgedessen darf nur die Äthanol-lösliche ADP-Komponente, deren 32P-Aktivität mit der Aktivität der mittleren Phosphorylgruppe von ATP identisch ist, zur Bildung des ATP/ADP-Quotienten herangezogen werden. Hierdurch erhöht sich der ATP/ADP-Quotient im ruhenden Muskel auf einen Wert von 9–10. Die Markierungsdifferenz zwischen beiden fraktioniert extrahierten Orthophosphat-Komponenten erreicht bei Muskelruhe einen Faktor 3. Im tetanisch gereizten Muskel ändern sich die Konzentration und die relative spezifische Aktivität des Äthanol-unlöslichen ADP und Orthophosphats — im Gegensatz zu den entsprechenden Äthanol-löslichen Komponenten — nicht. Die Markierungsdifferenz zwischen beiden fraktioniert extrahierten ADP-Komponenten wird bei Muskeltätigkeit — infolge Aktivitäts-Anstieg im Äthanol-löslichen ADP — noch um einen Faktor 2 im Vergleich zum ruhenden Muskel größer. Die relative spezifische 32P-Aktivität des Äthanol-löslichen Orthophosphats fällt im Augenblick der Kontraktion — infolge Verdünnung dieser Komponente mit weniger markiertem Orthophosphat aus dem Zerfall energiereicher Phosphat-Verbindungen — auf 1/3 des Ausgangswertes, d. h. auf das Niveau von ATP-Pγ im Ruhemuskel, ab. Dieser Befund ist eine Erklärung dafür, warum bei Verwendung von Phosphor-32 als Tracer — im Gegensatz zur H218O-Methode [2] — die Umsatzsteigerung von ATP-Pγ im tätigen Muskel nicht gemessen werden kann.Die Frage der Zuordnung der einzelnen — durch fraktionierte Extraktion erhaltenen — Phosphat-Komponenten zu bekannten morphologischen Muskelstrukturen sowie die Frage der Bedeutung des Äthanol-unlöslichen ADP und Orthophosphats für den Mechanismus der Kontraktion werden diskutiert.

Der Einfluß verschiedener Hemmstoffe des sarkoplasmatischen Reticulums auf die Kalium-Kontraktur und auf die Umsetzungen von energiereichen Phosphat-Verbindungen im isolierten Frosch-Sartorius

SummaryUsing the isolated frog sartorius muscle, the isometric tension development and the concentration of creatine phosphate (CP) have been measured in isotonic KCl solution at 20° C. Experiments were performed to determine why the contracture induced by high potassium chloride is not sustained and the regeneration of the PC content begins after a few minutes in spite of continuous depolarization.Preincubation of the muscle in Ringer solution containing 4.5 mM Ca++ (instead of 1.8 mM) leads to partial suppression of the twitch phase, prolongation of KCl contracture and to an inhibition of regeneration of PC content.After cooling the muscle to 0° C there is a noticeable delay of relaxation in isotonic KCl and a simultaneous inhibition of regeneration of PC content.In the presence of known in vitro inhibitors of the Ca++-uptake in fragmented sarcoplasmic reticulum such as SCN−, thymol or caffeine, an enhancement of KCl contracture (in respect to the magnitude of twitch and the prolongation of duration) takes place. Under these conditions the regeneration of the PC content can be completely blocked.The investigations show that under conditions of continuous depolarization the relaxation and the regeneration of the PC content are due to the Ca++-binding of the sarcoplasmic reticulum. The process of relaxation therefore may be controlled by intracellular membranes and not by the electrical state of the surface membrane.The results are discussed with respect to problems which take into account the function of different membrane sites as well as the morphological components of the intracellular Ca++-turnover.ZusammenfassungAm isolierten Frosch-Sartorius wurde die isometrische Spannungsentwicklung und die Konzentration an Phosphorylkreatin (PKr) in isotonischer KCl-Lösung in Funktion der Zeit gemessen. Dabei sollte die Ursache für das spontane Einsetzen der Erschlaffung und der Regeneration der Bestände an PKr während der Dauerdepolarisation aufgeklärt werden.Vorbehandlung des Muskels in Ringer-Lösung mit 4,5 mM Ca++ (statt normal 1,8 mM) unterdrückte die schnelle Phase der KCl-Kontraktur und führte zur Verlängerung der Kontrakturdauer. Der Wiederanstieg der Konzentration an PKr vollzog sich dabei langsamer als in KCl-Lösung mit normalem Ca++-Gehalt.Kühlung des Muskels von 20° C auf 0° C bewirkte eine auffällige Erschlaffungs-verzögerung in isotonischer KCl-Lösung bei gleichzeitiger Hemmung der Regeneration der Bestände an PKr.In Gegenwart bekannter in vitro-Inhibitoren der Ca++-Aufnahme in die Vesikel des sarkoplasmatischen Reticulums (wie SCN−, Thymol und Coffein) kam es zu einer Verstärkung der KCl-Kontraktur hinsichtlich Höhe und Dauer sowie zur Ausbildung eindeutiger Verkürzungsrückstände. Die Regeneration der Bestände an PKr verlief dabei stark verzögert und war bei gleichzeitiger Anwesenheit von SCN− und Thymol vollständig blockiert.Die Untersuchungen zeigen, daß bei funktioneller Ausschaltung der Oberflächenmembran durch K+-Depolarisation das Einsetzen der Erschlaffung und der Regeneration der Bestände an PKr abhängt von der Ca++-Rückbindung in die Vesikel des sarkoplasmatischen Reticulums. Der Prozeß der Erschlaffung würde demnach kontrolliert durch die Funktion intracellulärer Membranstrukturen und nicht durch den elektrischen Zustand der Oberflächenmembran.Die Frage der Funktion einzelner Membranabschnitte sowie die Frage der morphologischen Komponenten des intracellulären Ca++-Turnovers werden im Hinblick auf die Kompartmentierung der Muskelzelle diskutiert.

Aktivierungsanalyse des stabilen Sauerstoff-Isotops O18

Da Weekreize in die Untersuehung der Sehlaftiefe eine quant i ta t iv nicht fagbare Variable einffihren, mfissen Methoden der Schlaftiefenmessung nicht nur weckreiz-, sondern fiberhaupt beeinflussungsfrei sein. Es wird fiber ein Verfahren berichtet, das elektrencephalographische Befunde mit anderen Kriterien des natfirliehen Sehlafes verkniipft und zu quanti tat iven Aussagen fiber die Sehlaftiefe bis herunter zu sehr kurzen Zeitabsehnitten (Sekunden) fiihrt. Das Waeh-EEG wird in iiblicher Weise in zwei, das Sehlaf-EEG in Anlehnung an CASP]~RS in drei Stadien eingeteilt. Diese werden ffir jede Versuehssekunde ermittelt und graphisch dargestellt. Die minimalen und i~uBerlieh nicht erkennbaren Bewegungen der mimischen Muskulatur und Bulbi, die in der t t i rns t romkurve als Grundlinienschwankungen mitregistriert werden, bilden ein zweites Kri ter ium der Sehlaftiefe (Z Beweg./Zeit). Ein drittes ist die tI/iufigkeit des Uberganges yon einem Stadium in das andere (Z Stad./Zeit). Aus einem Material yon etwa 160 Versuehen an 15 t Iunden wurden je zwei an 6 Hunden herangezogen. Mit Hilfe der Varianzanalyse mat Duneantest und anderer mathematisehstatistiseher Auswertungsmethoden ergibt sich 1. eine feste Zuordnung der Z Beweg./Zeit zum EE G-Stadium, die gegenfiber den Wachstadien stark f/~llt und im mittleren und tiefen Schlafstadium gleich Null ist. Diese letzten beiden kann man durch die ~ Stad./Zeit trennen. 2. Wenn man unsystematische Einflfisse, z.B. die Ausgangslage berficksiehtigt, verhalten sich alle Tiere im selben Stadium gleich. 3. Die Versuchsergebnisse lassen sieh beim einzelnen Tier reproduzieren. 4. Tiere unter Luminal sind anhand der ZBeweg./Zei t im gleiehen Stadium yon unbeeinfluBten nieht zu unterscheiden ( W E ~ ] ~ u. FaUCeT). Das Verfahren ist auch am Mensehen anwendbar.