Ju Jianhua

Marinacarbolines甲基化基因 mcbD 的筛选及其功能

目的定位Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组中负责marinacarbolines甲基化修饰的基因mcbD并鉴定其功能。n 方法游离M.thermotolerans SCSIO 00652的基因组序列中功能注释为甲基转移酶的蛋白，使用MEGA 6自带的ClustalW与来自于marformycins生物合成途径中的MfnG（D/L-酪氨酸甲基化酶）进行多序列比对，用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，筛选到与MfnG进化关系最近的Orf03255（McbD）；扩增mcbD后克隆至pET28a（+）并在E.coli BL21（DE3）中表达，结合Ni-NTA亲和层析法纯化获取较高纯度的McbD活性蛋白；以marinacarboline B为底物，利用高效液相色谱检测McbD的体外酶活；利用基于PCR-targeting的遗传操作体系构建mcbD插入失活突变株（ΔmcbD）并分析其与野生型菌株的发酵产物差异。n 结果N-末端融合组氨酸标签的McbD蛋白在E.coliBL21（DE3）中可溶性表达，亲和层析纯化的McbD能够以marinacarboline B为底物催化形成marinacarboline C；mcbD基因阻断突变株ΔmcbD与野生型相比不产生化合物marinacarboline C，同时累积marinacarboline B。n 结论McbD为marinacarbolines生物合成中必需的O-甲基转移酶。