Karel Beneš

A contribution to the histochemical demonstration of some hydrolytic and oxidative enzymes in plants.

SummaryIn this work an attempt was made to apply to plant material some recent methods for studying enzymes in situ enabling even the intracellular localization. The following enzymes were demonstrated in the root tip of the broad bean: acid phosphatase, non-specific esterase, DPN tetrazolium reductase and the system of lactic acid dehydrogenase. The attempts to reveal the alcaline phosphatase were not successful even in unfixed material. A comparison was made of different techniques, their advantages and/or possible sources of errors were discussed. With fixed material satisfactory results were obtained.

Position and extent of the elongation zone in the root tip of the broad beanVicia faba L.

It was found by measuring the length of the cortex cells of the root tips of the broad beanVicia faba L. that the beginning of the elongation zone lies at about 1–2 mm from the initials and its end at about 7–8 mm from the initials. Shrinkage of the object during microtechnical treatment was negligible. The autonomy of the individual tissues of the root tip was taken into account.AbstractMěřením délky buněk primární kůry kořenových špiček koňského bobu Vicia faba L. bylo zjištěno, že počátek prodlužovací zony leží v oblasti 1 až 2 mm od iniciál a její konec ve vzdálenosti 7 až 8 mm od iniciál. Smrsknutí objektu při mikrotechnickém zpracování bylo nepatrné. Byla uvážena autonomie jednotlivých pletiv kořenové špičky.AbstractИзмерением длины клеток первичной коры корневых верхушекVicia faba L. установлено, что начало зоны удлинения лежит в области от 1 до 2 мм от инициальных клеток а ее конец на расстоянии 7–8 мм от них. Рассматривается автономия отдельных тканей корневой верхушки.

Localization of acid phosphatase in the differentiating root meristem

The localization of acid phosphatase was studied by Gomori’s newer technique and by azo-coupling methods (α-naphthyl phosphate + fast red ITR or fast garnet GBC; AS or AS D phosphate + fast blue B or fast red violet LB) in the root tips ofVicia faba L. on paraffin sections (fixation with Wolman’s acidified ethanol) and on frozen sections (fixation with Baker’s calcium formol). Analogous results were obtained on the material treated in various ways and using different methods. In the broad bean, the reaction is most intense in the cap. In the meristematic zone, the primary core is more intensely stained than the ground parenchyma of the central cylinder. The phloem and xylem poles are usually strongly positive. Using both types of methods on Wolman fixed paraffin embedded material, essentially the same localization of acid phosphatase was found in the root tips ofRicinus communis L.,Lupinus luteus L.,Sinapis alba L.,Allium cepa L. as in the broad bean. InZea mays L. the rhizodermis and the hypodermic layers of the primary core were found to be most active. On sections of Wolman fixed paraffin embedded broad bean the most intense reaction was observed at pH 4.2–4.8. In the same material, both the azo-coupling and the Gomori reaction is inhibited by 10=2 M NaF, but 10−2 M tartaric acid only inhibits the Gomori reaction.AbstractU kořenových špiček bobuVicia faba L. jsme sledovali novější metodou Gomoriho s glycerofosfátem a azokopulačními metodami (α-naftylfosfát + fast red ITR nebo fast garnet GBC; AS nebo ASD fosfát + fast blue B nebo fast red violet LB) v parafinových řezech (fixace Wolmanovou směsí) a vřezech zmrazených (fixace Bakerovým kalciumformolem) lokalizaci kyselé fosfatázy. Stejné výsledky jsme dostali u různě zpracovaného materiálu i při aplikaci různých metod. U bobu je nejintenzjevnější reakce v čepičce, primární kůra jeví v meristematické zóně silnější zbarvení než střední válec. V středním válci bývají silně pozitivní lýkové a dřevní póly. U většiny ostatních testovaných objektů (kořenové špičky skočce obecnéhoRicinus communis L., vlčího bobu žlutéhoLupinus luteus L., hořčice bíléSinapis alba L., eibule kuchyňskéAllium cepa L.) byla zjištěna metodami obou typů v podstatě stejná lokalizace kyselé fosfatázy jako u bobu. U kukuřiceZea mays L. byla nejaktivnější rhizodermis a hypodermální vrstva primární kůry. Na parafinových řezech bobu jsme zjistili nejintenzivnější reakci při pH 4,2 až 4,8; azokopulační i Gomoriho reakce je na tomto materiálu inhibována 10−2m NaF, 10−2m kyselina vinná inhibuje jen Gomoriho reakei.AbstractМы изучали у корневых верхушек бобаVicia faba L. при иомощи нового метода Гомори с глицерофосфатом и при помощи азокопуляционных методов (α-нафтилфосфат + фаст ред ITR или фаст гарнет GBC; AS или ASD-фосфат + фаст блю B нли фаст ред виолет LB) в парафиновых срезах (фиксация смесью Вольмана) и в замороженных срезах (фиксация кальцийформолом Бейкра) локализацию кислой фосфатазы. Одинаковые результаты мы нолучили в по-разному обработанном материале и в случае применения разных методов. У конского боба наиболее интенсивна реакция в калиптре, первичная кора является в меристематической зоне более окрашенной по сравнению с центральным стержнем. В центральном стержне находятся иногда интенсивно положительные лубяные и древесные полосы. У большинства изученных объектов (корневые верхущки клещевиныRicinus communis L., желтого люпинаLupinus luteus L., горчицы белойSinapis alba L., лукаAllium cepa L.) методами обоих типов установлена в сущности такая же локализациь кислой фосфатазы, какая имеет место и у конского боба. У кукурузыZea mays L. самой активной являлась ризодерма и гиподермальный слой первичной коры. На парафиновых срезах конского боба мы установили самую интенсивную реакцю при pH 4,2–4,8; азокопуляционная реакция и реакция Гомори ингирована на этом материале 10−2 M NaF, 10−2 M виноградная кислота тормозит только реакцию Гомори.

The anatomy of the shoot apex of wheat (Triticutn aestivum L.) during transition from the vegetative to the reproductive state and the determination of the primordia

An investigation was made of the anatomical structure of the shoot apex of wheat in the first four stages of organogenesis according toKuperman (1961). It was found that the shoot apex is first covered only with dermatogen (first stage). Then the hypodermis gradually differentiates (second stage) followed by differentiation of the subhypodermis (third stage). In the first stage, the central core of the apex is formed by more or less uniform isodiametric cells so that no zones are distinguishable. During the initiation of the primordia of the assimilating leaves, i.e. in the second stage, a group of larger cells was observed in the apical part of the hypodermis and can be compared with the central zone described in dicotyledons. Under it there is a characteristic group of smaller cells. In the third stage the differences between these groups of cells become less clear and in the fourth stage are no longer observable. No differences were found in the manner of initiating the leaf and bud primordia during the period of ontogenesis studied. There is, however, an alteration in the extent of growth between the bud primordium and the corresponding leaves. Short-day photoperiodic inhibition, always started on the days when the shoot apices were collected for anatomical study, showed that the determination of the primordia of the leaves and axillary buds as parts of the inflorescence is complete by the end of the third stage, at the time when the primordia in the central part of the ear are initiatedAbstractSledovali jsme vývoj anatomické stavby vzrostného vrcholu pšenice v prvních čtyřech etapách organogeneze podleKupermanové (1961). Zjistili jsme, že na vzrostném vrcholu zprvu krytém jen dermatogenem (v 1. etapě) se postupně vytváří hypodermis (v 2. etapě) a subhypodermis (ve 3. etapě). Centrální dřeň vrcholu je v 1. etapě tvořena přibližně stejnými, isodiametrickými buňkami, takže zde není patrná žádná zonace. Při zákládání asimilačních listů, tj. ve 2. etapě jsme pozorovali v apikální části hypodermis skupinu větších buněk, kterou lze srovnávat s centrální zónou popsanou u dvouděložných rostlin, a pod ní charakteristickou skupinu menších buněk. Ve 3. etapě se rozdíly mezi těmito skupinami buněk stírají a ve 4. etapě mizí. Nezjistili jsme rozdíly ve způsobu zákládání listů a pupenů během ontogeneze. Mění se však vztah mezi základy pupenů a okolních listů.Fotoperiodickou krátkodenní inhibicí, započatou vždy ve dnech odběrů vzrostných vrcholů pro sledování anatomické struktury, jsme zjistili, že determinace listů a úžlabních pupenů jako částí květenství je úplná až na konci 3. etapy, tj. v době zakládání primordií ve střední časti klasu.Abstractлеслелолось развитие анатомиуеской структкуры конуеа нарастания шценицы Я. Опатрна, ϕ.Сайдлова, к.Бенеш, лнститут экспериментальной ботаники ЧСАН, в первых этапах органогенеза по куперман. Сначала конус нарастания покрыт тлько дерматогеном (1-ый этап органогенеза). На первом зтапе центральная часть конуса нарастания состоит из почти одинаковых изодиаметрических клеток, такчто никаких зон отличить группу более крупных клеток в гиподермисе. Этагруппа напоминает центральную зону описанную у двудольных растений. Под ней находися хароктеристичестич еская группа более мелких клеток. В течение 3-его этапа

The effect of 9-(2,3-dihydroxypropyl) adenine (DHPA) on seedling roots ofVicia faba L. in comparison with adenine, adenosine and some cytokinins

Abstract3-day-old seedlings ofVicia faba L. were put onto a diluted Knop’s solution containing the tested substances within the intentional concentration range and left there for 7 days. In comparison with controls in plain nutrient solution, the DHPA treated plants revealed a suppression of shoot and root development. The main root growth was less sensitive than root branching. 8 h exposure was sufficient to gain a distinct effect. Microscopically the block of mitosis and/or cytokinesis, the formation of binucleate cells and local tissue damage were revealed. Under the given conditions, the cytokinins (BAP, (9R)BAP, iP, (9R)iP) proved to be much more powerful inhibitors than DHPA, whereas adenine and adenosine were less impairing.

The presence and distribution of α and β glucosidase in root tip

A comparison was made of post and simultaneous azocoupling procedures for β glucosidase localization on unfixed and fixed root tips ofZea mays. Using this object, more detailed studies of β glucosidase distribution were undertaken, concerning the time course of enzyme reaction, its pH dependence, the effect of various buffers, the comparison of several diazonium salts and the use of different naphtholic substrates. The indigogenic reaction was also applied. Attempts were made by means of azocoupling procedures to localize a and β glucosidase in root tips ofCucurbita pepo, Lupinus albus, Piswm sativum andVicia faba in comparison withZea mays. In addition to certain technical problems, the questions of constitutive and adaptive enzymes, sugar distribution and histogenesis versus function are discussed in relation to the presence and distribution of ß glucosidase in the studied objects.AbstractByla srovnána simultánní a postkopulační metoda k průkazu β glukosidásy na nefixovaných i fixovaných kořenových špičkách kukuřice. Na tomto objektu byly pak provedeny další studie: byl sledován časový průběh reakce, závislost na pH, působení různých pufrů, bylo porovnáno několik diazoniových solí a různé naftolové substráty. Bylo rovněž použito indigogenní reakce. Azokopulačně byla zjišïována α a β glukosidasa v kořenových špičkách několika dalších druhů rostlin. Kromě některých metodických otázek zahrnuje diskuse problémy konstitutivních a adaptivních enzymů, přítomnosti přirozených substrátů (glycidů) a podmíněnosti lokalisace enzymů histogenesí nebo funkcí.

Cytochemical and electron-microscopic investigation of the golgi apparatus and golgi-resembling inclusions in the root meristem ofFagopyrum esculentum moench

Souhrn1. Klasickými cytologickými metodami, cytochemicky a elektronmikroskopicky byla studována cytoplasma pohanky. 2. Cytochemické studium inklusí podobných Golgiho aparátu bylo provedeno po fixaci Ca formolem a zalití do karbowaxu. 3. Byla vypracována charakteristika inklusí. Inkluse se podobají cytochemicky některým pigmentovým substancím živočišných buněk (lipopigmenty, fenolové pigmenty). 4. Byly studovány podmínky barvení inklusí basickými barvivy, sudanovou černí B a reakce kyselina jodistá-Schiffovo činidlo. 5. Funkční studium ukázalo podobný cyklus, jaký je znám při tvorbě sekretů v živočišných buňkách. 6. Golgiho aparát a jemu podobné inkluse se jeví pod elektronovým mikroskopem jako dvě různé složky.Summary1. The classical cytological methods, cytochemistry and electron microscopy were used to study the cytoplasm ofFagopyrum esculentumMoench. 2. Cytochemical investigation of inclusions resembling the Golgi apparatus was possible after fixation in Ca-formaldehyde and embedding in carbowax. 3. A characteristic of the inclusions was drawn up. The inclusions resemble some pigment substances of animal cells cytochemically (lipopigments, phenolic pigments). 4. Conditions of staining inclusions with basic dyes, Sudan black B and the PAS reaction were studied. 5. A functional investigation revealed a cycle resembling that known in the formation of secretions in animal cells. 6. The Golgi apparatus and inclusions resembling it appear under the electron microscope as two distinct components.РезюмеЦитоплазма гречихи изучалась нами классическим цитологическим, цитохимическим и электронмикроскопическим методами. Цитохимическое нзучение включений, похожих на аппарат Гольджи, обусловлено применением метода фиксации Са-формальдегидом и заливкой в карбовакс. Выработана характеристика включений. Включения цитохимически похожи на пигментные субстанции животных клеток. Изучен механизм окраски включений основными красителями и судановым черным и PAS-реакцией. Изучение с функциональной точки зрения выявило цикл, известный для образования секретов в животных клетках. Аппарат Гольджи и похожие на аппарат Гольджи включения кажутся под электронным микроскопом двумя независимыми образованиями.

Detection of lipids in the plant meristematic cell with the aid of Sudan black staining

As lipids can be a source of artefacts during intracellular localization of enzymes by cytochemical methodsin situ it was the aim of the present work to obtain orientation data on the distribution of lipids in the meristematic plant cells. The different fixation and object embedding methods examined revealed that it is best to fix the material by some formol fixative and without chroming, to embed it in polyethyleneglycol media. An alcoholic solution of Sudan black was found to be most reliable. In the meristematio cells the cytoplasm is usually stained more intensely than the nucleus. The ground cytoplasm is stained weakly while cytoplasmic particles are stained intensely. In some cases an intense black staining of nuclei, particularly in the prolongation zone, can be achieved. The staining intensity of cell components does not decrease on extracting lipids with pyridine. After extracting the dye from stained cell components a browninsh residual coloration remains. Chromatography of Sudan black revealed in all the samples tested slowly moving spots (blue and violet) and rapidly moving ones (red II, yellow, red I, colourless).AbstractProtože lipidy mohou být zdrojem artefaktů při intracelulární lokalizaci enzymů cytochemickými metodami in situ, bylo cílem této práce získat orientační údaje o distribuci lipidů v meristematických buňkách rostlin. Pokud jsem zkoušel různé způsoby fixace a zalití objektů, je vhodné fixovat materiál některou formolovou fixáží, nechromovat a zalévat do polyethylenglykolových médií. Alkoholický roztok sudanové černi je nejspolehlivejší. V meristematických buňkách se cytoplazma obvykle barví intenzivněji než jádro. Základní cytoplazma je obarvena slabě, intenzívní je zbarvení cytoplazmatických partikulí. V některých případech lze dosáhnout intenzivní ho černého zabarvení jader, zejména v prolongační zóně. Intenzita zbarvení buněčných složek se nesníží extrakcí lipidů pyridinem. Po extrakci barviva z obarvených složek buňky zůstává hnědavé zbytkové zbarvení. Chromatografieky byly ve všech testovaných vzorcích sudanové černi zjištěny vedle pomalu postupujících skvrn (modrá a fialová) rychle postupující skvrny (červená II, žlutá, červená I, bezbarvá).AbstractТак как липиды могут быть исиочником артеϕактов при интрацеллюлярной локализации энзимов цитохимическими реакциями in situ, целью данной работы ставилось получить ориентировочные данные относительно дистрибуции липидов в меристематических клетках растений. Поскольку я изучал разные методы ϕиксации и заливки обьектов, то лучшим методом является ϕиксадия материала некоторой из ϕормолных ϕиксаций, избегать хромирования и заливать в полиэтиленгликолов ые среды. Самым надежным является раствор судановой черной в алкоголе. В муристематических клетках цитоплазма окрашивается интенсивнее по сравнерию с ядром. Основная цитоплазма окрашивается слабо, более интенсивно окрашены цитоплазматические включения. В некоторых случаях возможо добиться интенсивно черной окрϕски яцер, особенно в зоне удлиняющего роста. Интенсивность окраски частей клетки не снижается при экстрагировании липидов пиридином. Хроматограϕическим методом установлены во всех изучаемых пробах судановой чсрной кроме медленно движущихся пятен (синсс и ϕиолетовое) быстро движущиеся пятна (красное II, желтое, красное I, бесцветное).

The localization and the isoenzymes of α- and β-Galactosidases in root tips

The localization was studied of α- and β-galactosidases in frozen sections of Ca-formol fixed root tips using simultaneous azocoupling reaction. In all species studied (Allium cepa,Cucurbita maxima, Lupinus albus, Pisum sativum, Vicia faba, Zea mays) positive results were obtained, the localization being ubiquitous (according to localization typology given here).InVicia faba andZea mays the isoenzymes of α- and β-galactosidases were revealed by means of acrylamide gel electrophoresis, using authors’ modification of Reisfeld method, in whole root tips, particular growth zones and separately in cortex and central cylinder. No differences were observed comparing stele and cortex. Whereas characteristic isoenzyme patterns were found in individual growth zones in maize, no differences appeared in broad bean.A comparison was made of thein situ localization and of the isoenzyme patterns of α- and β-galactosidases with α- and β-glucosidases. In the case of galactosidases, positive results appear with both α- and β-galactoside. The rising of pH to neutrality leads to considerable decrease in the activity of both galactosidases.

The localization of starch in root tips

As an extension of earlier studies performed in our laboratory on enzyme localization on tissue level, the distribution of starch was examined in seedling root tips of peaPisum sativum L., broad beanFaba vulgarisMoench., maizeZea mays L., lupinLupinus albus L., and pumpkinCucurbita maximaDuch., and in tips of adventive roots of onionAllium cepa L. by means of the alcian blue /JJK procedure applied to paraffin sections. In pea, some genetic (various cultivars) and eco-physiological (different harvests, various localities, diverse way of germination, uneven seedling age, unequal stage of cell growth) factors were studied concerning the present problem. In all these cases the starch localization pattern remains constant though the amounts of starch vary in particular cell complexes. From the evaluation of the starch localization at the level of the beginning cell growth in particular species and from comparison of the findings in different species it follows that starch localization and histogenesis patterns are different. This supports the view that the two phenomena are caused or controlled by uneven factors.