Karel Krofta

The Draft Genome of Hop (Humulus lupulus), an Essence for Brewing

The female flower of hop (Humulus lupulus var. lupulus) is an essential ingredient that gives characteristic aroma, bitterness and durability/stability to beer. However, the molecular genetic basis for identifying DNA markers in hop for breeding and to study its domestication has been poorly established. Here, we provide draft genomes for two hop cultivars [cv. Saazer (SZ) and cv. Shinshu Wase (SW)] and a Japanese wild hop [H. lupulus var. cordifolius; also known as Karahanasou (KR)]. Sequencing and de novo assembly of genomic DNA from heterozygous SW plants generated scaffolds with a total size of 2.05 Gb, corresponding to approximately 80% of the estimated genome size of hop (2.57 Gb). The scaffolds contained 41,228 putative protein-encoding genes. The genome sequences for SZ and KR were constructed by aligning their short sequence reads to the SW reference genome and then replacing the nucleotides at single nucleotide polymorphism (SNP) sites. De novo RNA sequencing (RNA-Seq) analysis of SW revealed the developmental regulation of genes involved in specialized metabolic processes that impact taste and flavor in beer. Application of a novel bioinformatics tool, phylogenetic comparative RNA-Seq (PCP-Seq), which is based on read depth of genomic DNAs and RNAs, enabled the identification of genes related to the biosynthesis of aromas and flavors that are enriched in SW compared to KR. Our results not only suggest the significance of historical human selection process for enhancing aroma and bitterness biosyntheses in hop cultivars, but also serve as crucial information for breeding varieties with high quality and yield.

Cloning and molecular analysis of HlbZip1 and HlbZip2 transcription factors putatively involved in the regulation of the lupulin metabolome in hop (Humulus lupulus L.)

Hop (Humulus lupulus L.), the essential source of beer flavor is of interest from a medicinal perspective in view of its high content in health-beneficial terpenophenolics including prenylflavonoids. The dissection of biosynthetic pathway(s) of these compounds in lupulin glands, as well as its regulation by transcription factors (TFs), is important for efficient biotechnological manipulation of the hop metabolome. TFs of the bZIP class were preselected from the hop transcriptome using a cDNA-AFLP approach and cloned from a cDNA library based on glandular tissue-enriched hop cones. The cloned TFs HlbZIP1A and HlbZIP2 have predicted molecular masses of 27.4 and 34.2 kDa, respectively, and both are similar to the group A3 bZIP TFs according to the composition of characteristic domains. While HlbZIP1A is rather neutral (pI 6.42), HlbZIP2 is strongly basic (pI 8.51). A truncated variant of HlbZIP1 (HlbZIP1B), which is strongly basic but lacks the leucine zipper domain, has also been cloned from hop. Similar to the previously cloned HlMyb3 from hop, both bZIP TFs show a highly specific expression in lupulin glands, although low expression was observed also in other tissues including roots and immature pollen. Comparative functional analyses of HlbZip1A, HlbZip2, and subvariants of HlMyb3 were performed in a transient expression system using Nicotiana benthamiana leaf coinfiltration with Agrobacterium tumefaciens strains bearing hop TFs and selected promoters fused to the GUS reference gene. Both hop bZIP TFs and HlMyb3 mainly activated the promoters of chalcone synthase chs_H1 and the newly cloned O-methyl transferase 1 genes, while the response of the valerophenone synthase promoter to the cloned hop TFs was very low. These analyses also showed that the cloned bZIP TFs are not strictly G-box-specific. HPLC analysis of secondary metabolites in infiltrated Petunia hybrida showed that both hop bZIP TFs interfere with the accumulation and the composition of flavonol glycosides, phenolic acids, and anthocyanins, suggesting the possibility of coregulating flavonoid biosynthetic pathways in hop glandular tissue.

The "putative" role of transcription factors from HlWRKY family in the regulation of the final steps of prenylflavonid and bitter acids biosynthesis in hop (Humulus lupulus L.).

Lupulin glands localized in female hop (Humulus lupulus L.) cones are valuable source of bitter acids, essential oils and polyphenols. These compounds are used in brewing industry and are important for biomedical applications. In this study we describe the potential effect of transcription factors from WRKY family in the activation of the final steps of lupulin biosynthesis. In particular, lupulin gland-specific transcription factor HlWRKY1 that shows significant similarity to AtWRKY75, has ability to activate the set of promoters driving key genes of xanthohumol and bitter acids biosynthesis such as chalcone synthase H1, valerophenone synthase, prenyltransferase 1, 1L and 2 and O-methyltransferase-1. When combined with co-factor HlWDR1 and silencing suppressor p19, HlWRKY1 is able to enhance transient expression of gus gene driven by Omt1 and Chs_H1 promoters to significant level as compared to 35S promoter of CaMV in Nicotiana. benthamiana. Transformation of hop with dual Agrobacterium vector bearing HlWRKY1/HlWDR1 led to ectopic overexpression of these transgenes and further activation of lupulin-specific genes expression in hop leaves. It was further showed that (1) HlWRKY1 is endowed with promoter autoactivation; (2) It is regulated by post-transcriptional gene silencing (PTGS) mechanism; (3) It is stimulated by kinase co-expression. Since HlWRKY1 promotes expression of lupulin-specific HlMyb3 gene therefore it can constitute a significant component in hop lupulin regulation network. Putative involvement of HlWRKY1 in the regulation of lupulin biosynthesis may suggest the original physiological function of lupulin components in hop as flower and seed protective compounds.

Qualitative determination of β-acids and their transformation products in beer and hop using HR/AM-LC-MS/MS.

Hops represent an important source of β-acids with antimicrobial and sensory properties. Transformation products of β-acids formed during their oxidation, mainly hulupones, have been shown to have an interesting kind of bitterness. Their structures were recently elucidated using LC-TOFMS and 1D/2D NMR in solution after thermal treatment of the hop β-acids. This study demonstrates the advantages of MS detection with high resolution and accurate mass measurements. The structure of transformation products in an experimental solution of oxidized β-acids was elucidated using a newly developed method by hybrid quadrupole-Orbitrap MS. In addition to already known structures, two new ones were identified and named epoxycohulupone and epoxyhulupone. The method was verified on real samples; the profiles of these products in Sládek hops harvested in 2008 and 2012 and in corresponding beers were compared. For this purpose, a new QuEChERS assay was used for the preparation of beer samples.

Zjišťování autenticity českých odrůd chmele pomocí chemických a molekulárně-genetických analýz.

Historie zaznamenává mnoho případů falsifikace potravin a zemědělských produktů (víno, med, destiláty, ovocné džusy, olivový olej, tabák, káva, sýry, koření, čaj aj.). Nekvalitnější, a tudíž i nej dražší produkty byly v historii, a bohužel i nadále jsou, upravovány přídavkem laciněj ších druhů, náhražek, aditiv apod. a jsou falešně vydávány za zboží prvotřídní kvality. V případě chmele je za nejkvalitnější surovinu všeobecně považován Žatecký poloraný červeňák (ŽPČ), tradiční česká odrůda chmele. V druhé polovině 20. století bylo vyšlechtěno a zavedeno do ko merčního pěstování několik desítek nových odrůd chmele. Trend rychlé obměny pěstovaných odrůd chmele, který pružně reaguje na potřeby pivovarského průmyslu, trvá i v současné době. S tím současně vyvstala potřeba identifikace

Secondary metabolites, antioxidant and anti-proteinase activities of methanolic extracts from cones of hop (Humulus lupulus L.) cultivars

Contents of polyphenols, flavonoids, bitter acids, α-bitter acids, xanthohumol, desmethylxanthohumol, essential oils, antioxidant activities, and inhibitory activities against trypsin, thrombin, urokinase, and papain were analysed in methanolic extracts prepared from the hope cones. Significant differences between extracts from eight hop cultivars in all measured parameters were found. Two cultivars—Agnus and Vital—could be designated as the very special, all possessing high content of bitter acids, α-acids, essential oils, xanthohumol, and desmethylxanthohumol. The other two cultivars—Bohemie and Sládek—had interesting inhibitory activities against analysed proteinases. Differences between cultivars were also in content of total polyphenols, total flavonoids, as well as in antioxidant activity. All analysed hop cultivars developed originally for brewing contained also secondary metabolites with valuable biological activities related to health conditions associated with antioxidant status and some pathophysiological agents of proteinase character.

Saaz Late - česká odrůda chmele doporučená pro České pivo.

Ve šlechtění chmele lze v uplynulém desetiletí zaznamenat řadu nových trendů, z významných je možno jmenovat zakrslé odrůdy a odrůdy se specifickým aroma . Šlechtění zakrslých odrůd vhodných k pěstování v nízkých konstrukcích (Neve, 1991) bylo započato v Anglii již v 80 . letech minulého století . Velkou výhodou tohoto pěstitelského systému je podstatné snížení nákladů na výstavbu chmelnicové konstrukce a na pracovní sílu v jarním období . Původní trpasličí odrůdy se zde dnes pěstují na několika stech hektarech . Odrůdy jako např . First Gold, Herold, Pioneer či Pilgrim slouží nyní jako prvotní genetický materiál pro šlechtění tohoto typu chmelů i jinde ve světě (USA, Česká republika, Německo) . Další, v současné době velmi populární skupinou odrůd chmele jsou tzv . „flavour hops“ . Jedná se o odrůdy s atraktivním, senzoricky specifickým aroma, které se v plné míře uplatňuje i v pivu díky tomu, že se používají k tzv . „chmelení za studena“, přídavku chmele do ležáckých tanků ve studené fázi výroby piva . Takto chmelená piva získávají zcela jedinečnou chmelovou vůni díky tomu, že se senzoricky uplatňují látky, které běžně při chmelovaru bez užitku vytěkají z vroucí mladiny . Chmelení za studena je doménou především malých a restauračních pivovarů, ale Saaz Late – česká odrůda chmele doporučená pro České pivo

Metody pro ověřování autenticity odrůd chmele - účinný nástroj proti falzifikaci

Autenticita potravin je termín, který jednoduše označuje, zda potraviny nakupované spotřebitelem odpovídají jejich popisu, a je aktuálním tématem v nejrůznějších potravinářských komoditách. Proto je v současné době věnováno mnoho pozornosti a jsou vynakládány nemalé fi nanční prostředky na vývoj analytických metod pro ověřování autenticity potravin, nápojů a jejich surovin. Také chmel je komodita, ve které dochází k falzifi kaci původu a odrůd, což může ve velké míře ovlivnit senzorický profi l piva z něho vyrobeného. Žatecký poloraný červeňák (ŽPČ) je na trhu všeobecně považován za světový standard kvality v kategorii aromatických chmelů. Prvotřídní kvalitě odpovídá i vyšší cena. V uplynulých letech bylo zaznamenáno několik opakovaných případů jeho falzifi kace. Falzifi kace Žateckého poloraného červeňáku ve formě granulí byla DOI: 10.18832/kp2016030 Metody pro ověřování autenticity odrůd chmele – účinný nástroj proti falzifi kaci

Typizace českých chmelů z pohledu obsahu prenylflavonoidů.

Prenylovane flavonoidy patři mezi složky chmele s nejvýznamnějsimi zdravotně prospěsnými ucinky a znalost jejich obsahů a dynamiky jejich ubytku během zpracovani chmele patři k nezbytným předpokladům pro produkci piva se zvýseným obsahem těchto latek. Tato studie je zaměřena na dlouhodobe sledovani obsahu prenylflavonoidů, alfa-hořkých kyselin a jejich vzajemneho poměru v celem spektru tuzemských chmelových odrůd a take změn těchto parametrů v průběhu skladovani a zpracovani chmele. Bylo potvrzeno, že nově vyslechtěne odrůdy Agnus a Vital patři mezi odrůdy s nejvyssim obsahem prenylflavonoidů. Zejmena odrůda Vital je diky svemu chemickemu složeni velmi vhodna pro nepivovarske využiti. Na zakladě sledovani ubytku zminěných latek během zpracovani chmele bylo vsak zjistěno, že pro toto využiti bude zcela zasadni vyvinuti nových, setrnějsich postupů, zejmena pro suseni chmele, ktere by minimalizovaly riziko termicke a oxidativni degradace.

Stanovení hořkých látek v chmelu - vliv ročníku a stáří chmele

Krofta, K., Mikyška, A., Jurková, M., Mravcová, L., Vondráčková, P., 2017: Stanovení hořkých látek v chmelu – vliv ročníku a stáří chmele. Kvasny Prum. 63(5): 241–247 Práce je zaměřena na vzájemné porovnání čtyř metod stanovení alfa kyselin ve chmelu (EBC 7.4, EBC 7.5, ČSN a EBC 7.7) a jejich aplikaci při hodnocení chmele skladovaného za různých podmínek. Dále jsou diskutovány výsledky porovnání prognózovaných a skutečných hodnot alfa kyselin v dlouhodobém sledování sklizní tří českých odrůd chmele. Největší rozdíly byly zjištěny mezi metodami EBC 7.5 (KH) a EBC 7.7 (HPLC), prvá dává systematicky vyšší výsledky a rozdíl exponenciálně stoupá s hodnotou indexu skladování chmele (HSI), u čerstvých chmelů je rozdíl 10 – 15 % rel., u starších chmelů s HSI 0,6 – 0,7 je rozdíl 25 – 45 % rel. Předsklizňová prognóza i sklizňový odhad alfa kyselin v Žateckém poloraném červeňáku jsou v dobré shodě se skutečností (kr = 0,93; kr = 0,95), totéž platí i pro relaci sklizňového odhadu a skutečnosti odrůd Sládek a Premiant (kr = 0,93; kr = 0,97).