Kurt Repke

Immunologic identification of Na+,K(+)-ATPase isoforms in myocardium. Isoform change in deoxycorticosterone acetate-salt hypertension.

There are three isoforms of the catalytic (alpha) subunit of the Na+,K(+)-ATPase, each derived from a different gene, that differ in their sensitivity to inhibition by cardiac glycosides. Antibodies specific for the three isoforms were used to study Na+,K(+)-ATPase isoform expression in ventricular myocardium, where an understanding of digitalis receptor diversity is most important. In the rat heart, there is simultaneous expression of two isoforms in adult ventricle, and immunofluorescence studies demonstrated that both isoforms are expressed uniformly in cardiomyocytes. Hypertension and hypertrophy have been reported to selectively depress alpha 2 isoform mRNA levels, and we show in the present study that alpha 2 protein levels were correspondingly depressed in rats made hypertensive by uninephrectomy and treatment with deoxycorticosterone acetate and a high-salt diet. In the human heart, where mRNA for all three alpha isoforms has been reported, we detected all three isoform proteins (alpha 1, alpha 2, and alpha 3). Two isoforms (alpha 1 and alpha 3) predominated in the macaque heart; dissection of the heart showed uniformity of isoform expression in different ventricular regions but markedly less alpha 3 in the atrium. Finally, isoform-specific antibodies were used to detect which alpha isoforms were expressed in the ventricles of several commonly used experimental animals to test the correlation of isoform expression with cardiac glycoside-response heterogeneity. Two isoforms (alpha 1 and alpha 3) were found in canine myocardium, whereas only one (alpha 1) was found in sheep and guinea pig. Expression of Na+,K(+)-ATPase isoforms can thus be readily followed and related to the physiology of the digitalis receptor.

The lead structure in cardiac glycosides is 5 β,14 β-androstane-3 β,14-diol

SummaryThe purpose of the present study was to determine the lead structure in cardiac glycosides at the receptor level, i.e. the minimal structural requirement for specific and powerful receptor recognition. Accordingly 73 digitalis-like acting steroids were characterized as to the concentration effecting half-maximum inhibition of Na,K-ATPase from human cardiac muscle under standardized turnover conditions. Since the Ki value equaled the apparent KD value, K′D was expressed in terms of the apparent standard Gibbs energy change ΔGo′ of steroid interaction with Na,K-ATPase. This allowed the use of the extrathermodynamic approach as a rational way of correlating in a quantitative manner, the potency and structure of the various steroidal compounds.The results of the present analysis taken in conjunction with relevant findings reported in the literature, favour the following conclusions.1.Cassaine, canrenone, prednisolone- and progesterone-3,20-bisguanylhydrazone, and chlormadinol acetate are compounds that are not congeneric with digitalis.2.The butenolide ring of cardenolides or the analogous side-chains at C17β of 5β,14β-androstane-3β,14-diol are not pharmacophoric substructures, but merely amplifiers of the interaction energy of the steroid lead.3.All modifications of the structure, geometry and spatial relationship between the steroid nucleus and butenolide side chain of digitoxigenin all at once weaken the close fit interaction with the steroid and butenolide binding subsites of the enzyme in such way that the cardenolide derivatives interact with the receptor binding site area in whatever orientation that will minimize the Gibbs energy of the steroid-receptor-solvent system.4.The “butenolide carbonyl oxygen distance model” (Ahmed et al. 1983) for the interpretation of the differences in potency of the cardenolide derivatives describes the change in interaction energy through structural modification as a function of the entire molecule.5.5β,14β-androstane-3β,14-diol, the steroid nucleus of cardiac glycosides of the digitalis type, is the minimum structure for specific receptor recognition and the key structure for inducing protein conformational change and thus Na,K-ATPase inhibition. It is also the structural requirement for maximum contributions of the butenolide substituent at C17β and the sugar substituent at C3β-OH to the overall interaction energy, i.e. this steroid nucleus is the lead structure.6.The tridigitoxose side-chain at C3β-OH of digitalis glycosides can be more than isoenergetically replaced by glucose, 2′,3′-O-isopropylidene-rhamnose, digitoxose, rhamnose and 4′-deoxy-4′-amino-rhamnose (increasing order of interaction energy increments) indicating a remarkable degree of conformational adaptability of the sugar binding subsite.

Die fermentative Abspaltung von d-Digitoxose, d-Cymarose und l-Thevetose aus Herzglykosiden durch Leberschnitte

ZusammenfassungIn der vorliegenden Arbeit werden einleitend die Bedingungen beschrieben, unter denen das Stoffwechsel-Schniksal der Herzgifte in vitro studiert werden kann. Unter Ausnutzung dieser Voruntersuchung wird die Metabolisierung von 15 Vertretern (Digitoxigenin, Evomonosid, Proscillaridinin A, Neriifolin, Somalin, Digitoxigenin-mono-digitoxosid, Digitoxigenin-bis-digitixosid und Digitoxin; Digoxigenin, Digoxigenin-monotoxosid, Digoxigenin-bis-digitoxosid und Digoxin; Strophanthidin, Cymarin und Allo-cymarin) durch Schnitte aus Rattenleber verfolgt. Durch die Identifikation einer größeren Zahl von Metaboliten wird bewiesen, daß d-Digitoxose, d-Cymarose und l-Thevetose aus den entsprechenden Glykosiden unter Freisetzung der zugehörigen Genine abgespalten werden. Die relativen Spaltungsgeschwindigkeiten werden durch die Stellung der Zucker in den Polyglykosiden und die Polarität des Moleküls bestimmt. Wie gezeigt wird, eröffnet die Verwendung von Leberschnitten erstmals den Zugang zum Genin des Neriifolins. — Neben der Glykosidspaltung werden Hydroxylierung am C(12), Epimerisierung und Conjugation erhalten. Bei Somalin und Cymarin wird als weitere Metabolisierungsreaktion die Abspaltung der Methoxylgruppe aus der Cymarose-komponente erkannt. In Homogenaten oder Zellfraktionen aus Ratten-leber finden sich infolge der Labilität der Fermente im besten Fall nur etwa 8% der glykosidspaltenden Aktivität einer äquivalenten Menge von Schnitten. Die glykosidspaltenden Fermente, für die es bisher keine Parallele fibt, entziehen sich dadurch zunächst einer näheren Charakterisierung.Die in vitro gefundenen Zusammenhänge werden zu den in vivo mit Digitoxin, Digoxin, k-Strophanthin-γ und Thevetin gemachten Beobachtungen in Beziehung gesetzt, die dadurch einem tieferen Verständnis zugeführt werden. — Nach den Ergebnissen dieser Arbeit besteht die pharmakodynamische Funktion der Zuckerkomponente in den Herzglykosiden darin, die aufgefundenen Inaktivierungsreaktionen (Epimerisierung und Conjugation) zu blockieren. Durch diese Erkenntnis finden innerhalb der Cardenolid-Reihe die bekannten Differenzen in der Wirkungsdauer zweischen Glykosid und Genin und die Unterschiede in der Kumulationsneigung bestimmter Glykoside eine biochemische Erklärung.

Über Spaltung und Hydroxylierung von Digitoxin bei der Ratte

Ratten i.v. eingespritztes Digitoxin erfahrt durch Fermentwirkung eine schrittweise Kurzung der Digitoxosekette, die uber das Bis- zum Mono-Digitoxosid des Digitoxigenins fuhrt. Offenbar geht die Spaltung noch weiter; das Produkt ist jedoch nicht Digitoxigenin, sondern Digitoxigenin-Konjugat. Die beschriebene Glykosidspaltung scheint die hauptsachliche Abbaureaktion zu sein, die Digitoxin im Organismus erfahrt. — Digitoxigenin wird nur nach intragastraler Injektion von Digitoxin gefunden, jedoch bei geringen Mengen ausschlieslich im Magen und Dunndarm. Auf Grund dieser Feststellungen wird die Genin-Hypothese der Kumulation abgelehnt.ZusammenfassungRatten i.v. eingespritztes Digitoxin erfährt durch Fermentwirkung eine schrittweise Kürzung der Digitoxosekette, die über das Bis- zum Mono-Digitoxosid des Digitoxigenins führt. Offenbar geht die Spaltung noch weiter; das Produkt ist jedoch nicht Digitoxigenin, sondern Digitoxigenin-Konjugat. Die beschriebene Glykosidspaltung scheint die hauptsächliche Abbaureaktion zu sein, die Digitoxin im Organismus erfährt. — Digitoxigenin wird nur nach intragastraler Injektion von Digitoxin gefunden, jedoch bei geringen Mengen ausschließlich im Magen und Dünndarm. Auf Grund dieser Feststellungen wird die Genin-Hypothese der Kumulation abgelehnt.Neben der Glykosidspaltung läuft eine Hydroxylierung am Kohlenstoff 12 her, welche zur Bildung der entsprechenden Digoxigenin-Glykoside führt. Bestimmungen über den prozentualen Anteil der hydroxylierten Derivate an der jeweiligen Gesamtmenge Glykosid in Geweben und Ausscheidungen innerhalb der ersten zwei Tage nach Injektion von Digitoxin zeigen, daß die Hydroxylierung eine hervorragende Bedeutung für die Ausscheidung der Glykoside hat. In Verallgemeinerung dieser und anderer Feststellungen wird eine Theorie über die Ursache der unterschiedlichen Kumulationsneigung von Herzglykosiden aufgestellt, die als entscheidendes Differenzierungsmerkmal die Polarität des jeweiligen Glykosids und dessen Metaboliten herausstellt.

Die Bis- und Mono-digitoxoside des Digitoxigenins und Digoxigenins: Metaboliten des Digitoxins

ZusammenfassungNach intravenöser Injektion von Digitoxin bei Ratten werden aus 48 Std-Harn und -Kot 10 Verbindungen isoliert. Davon lassen sich 6 als Digitoxin, Digitoxigenin-bis-digitoxosid, Digitoxigenin-monodigitoxosid, Digoxin, Digoxigenin-bis-digitoxosid und Digoxigeninmono-digitoxosid identifizieren. Die Mutterverbindung Digitoxin stellt (auf molarer Basis berechnet) nur 6% des isolierten Materials. Hauptbestandteile sind vielmehr Digoxin (20%) und vor allem Digoxigenin-bis-digitoxosid (62%). Mit den erreichten Metaboliten-Identifikationen ist die Existenz einer „12β-Hydroxylase“ und einer „Digitoxosid-Hydrolase“ im tierischen und menschlichen Organismus gesichert. Die pharmakologische Bedeutung der Fermentreaktionen wird darin erkannt, Digitoxin der Ausscheidung oder Inaktivierung zuzuführen.

Entgiftungsgeschwindigkeit und Kumulation von Digitoxin bei verschiedenen Species

ZusammenfassungDigitoxin wurde mit Blut oder mit Gewebsschnitten aus der Leber verschiedener Species inkubiert. Mit Hilfe einer mikrochemischen Methode wurde die Geschwindigkeit des Abbaus zu chloroformunlöslichen, unwirksamen Metaboliten bestimmt. Eine Biotransformation von Digitoxin durch Blut von Ratte, Mensch oder Meerschweinchen war nicht nachweisbar. In vitro erwiesen sich die Lebern von Kröte, Frosch oder Mensch zu einem Abbau des Glykosids als unfähig. Leberschnitte von Taube, Katze, Meerschweinchen, Kaninchen und Hund zeigten in dieser Reihenfolge eine steigende Fähigkeit, Digitoxin in chloroformunlösliche Derivate umzuwandeln. — Die Speciesdifferenzen in der akuten Giftigkeit des Digitoxins stehen mit der jeweiligen Geschwindigkeit der Glykosidentgiftung nicht in Beziehung. Auf Grund der relativen Bedeutungslosigkeit der Digitoxinausscheidung bei Säugern einerseits und der Parallelität zwischen der Abbaugeschwindigkeit und Kumulationsneigung von Digitoxin bei verschiedenen Tierarten andererseits wird geschlossen, daß die Abbaugeschwindigkeit bestimmend für die Dauer der Digitoxinwirkung bei Säugern ist. Nur bei Fröschen und vielleicht auch Kröten ist die Ausscheidung von Digitoxin mit dem Harn der entscheidende Faktor. — Die unterschiedliche, kumulative Wirkung von Digitalisverbindungen verschiedener Struktur wird mit der Reversibilität ihrer Bindung am Digitalisreceptor beziehungsweise mit der Geschwindigkeit ihrer Ausscheidung oder Entgiftung in Zusammenhang gebracht.SummaryDigitoxin has been incubated with whole blood or with tissue slices from the liver of different species. The rate of degradation to chloroform-insoluble, inactive metabolites was determined by means of a microchemical method. There was no biotransformation of digitoxin by blood from rat, man or guinea-pig. In vitro, the livers of toad, frog and man proved unable to perform a degradation of the glycoside. Liver slices of pigeon, cat, guinea-pig, rabbit and dog showed in this order an increasing ability to tranform digitoxin into chloroform-insoluble derivatives.—The species differences in the acute toxicity of digitoxin are shown to be unrelated to the corresponding rates of the glycoside detoxication. Considering the relative insignificance of digitoxin excretion in mammals on the one hand and the close parallelism between degradation rate and cumulative power of digitoxin in the various species on the other hand, it is concluded that the degradation rate determines the duration of digitoxin action in mammals. In frogs and perhaps also in toads, however, the excretion of digitoxin by urine is the decisive factor. The different cumulative action of digitalis compounds of diverse structures has been related with the reversibility of their binding to the digitalis receptor and the rates of their excretion and detoxication, respectively.

Über die Verteilung herzglykosidspaltender Fermente im tierisehen Organismus

ZusammenfassungDie vorliegende Arbeit untersucht an Herzglykosiden des Typs Genin-(Desoxyzucker)n-(Glucose). bzw. des Typs Genin-(Desoxyzucker)n die Verteilung der glucose- bzw. desoxyzucker-abspaltenden Fermente im tierischen Organismus. Der Anteil, den tierische Fermente und mikrobielle Enzyme der Darmflora an den Glykosidspaltungenhaben, wird durch in vitro-Versuche mit Kot und verschiedenen Mikroorganismen, mit Fermentpräparaten, Gewebsschnitten und intakten Geweben sowie durch ergänzende in vivo-Experimente bestimmt. Die Glykosidspaltungen werden mit Hilfe der papierchromatographischen Analyse verfolgt. Als Maß für die Fermentaktivität wird die unter Standardbedingungen gebildete Menge an zuckerärmeren oder zuckerfreien Metaboliten genommen.Die körpervertrauteGlucose wird aus Herzglykosiden vorwiegend von mikrobiellen Enzymen abgetrennt. Dabei handelt es sich voraussichtlich um cellulolytische Fermente, die von den darmbewohnenden Bakterien aus der GattungClostridium gestellt werden. Jedenfalls wurde ein Zusammenhang zwischen dem Cellulosegehalt der Nahrung und der glykosidspaltenden Aktivität des Kots erkannt. Außerdem konnte der Nachweis geführt werden, daß die celluloseabbauenden BakterienCellvibrio vulgaris, Cellvibrio fulvus undSporocytophaga myxococcoides glatt die betreffende Spaltungsreaktion bewirken. — Tierische Fermente sind in der Regel an der Abspaltung der Glucose kaum oder nicht beteiligt. Die entsprechendeβ-Glucosidase läßt sich aber unter speziellen Bedingungen (pH 5) in Fermentpräparaten aus Leber nachweisen, jedoch entfaltet sie bei physiologischem PH gegenüber Herzglykosiden keine Aktivität.Die körperfremdenDesoxyzucker werden aus Herzglykosiden kaum von mikrobiellen Enzymen, sondern ganz überwiegend von tierischen Fermenten abgespalten. Zwar lassen sich diese Fermente in den meisten Organen, darunter auch im Herzen, nachweisen, jedoch sind sie vor allem in der Leber angereichert.In der Diskussion der Ergebnisse werden einige Besonderheiten der glykosidspaltenden Fermente besprochen und mögliche Zusammenhänge zwischen Glykosidspaltung und -Wirkung bzw. -kumulation erwogen.

LOCATION AND PROPERTIES OF THE DIGITALIS RECEPTOR SITE IN NA+/K+-ATPASE

Since 1985, several research groups have shown that a number of amino acids in the catalytic α‐subunit of Na+/K+‐ATPase more or less strongly modulate the affinity of a digitalis compound like ouabain to the enzyme. However, scrutiny of these findings by means of chimeric Na+/K+‐ATPase constructs and monoclonal antibodies has recently revealed that the modulatory effect of most of these amino acids does not at all result from direct interaction with ouabain, but rather originates from long‐range effects on the properties of the digitalis binding matrix. Starting from this knowledge, the present review brings together the various pieces of evidence pointing to the conclusion that the interface between two interacting α‐subunits in the Na+/K+‐ATPase protodimer (αβ)2 provides the cleft for inhibitory digitalis intercalation.

Die chemische Bestimmung von Digitoxin in Geweben und Ausscheidungen

ZusammenfassungIn der vorliegenden Arbeit wird der Nachweis geführt, daß Digitoxin mit chemischen Mitteln in Geweben und Ausscheidungen quantitativ bestimmt werden kann. Die Methodik gründet sich zunächst auf ein Verfahren zur serienmäßigen Extraktion des Glykosids durch maschinelles Ausschütteln der entsprechenden Homogenate oder Flüssigkeiten mit Chloroform. Ein weiterer Bestandteil der Methodik ist die Reinigung und Fraktionierung der erhaltenen Extrakte durch Adsorption an Aluminiumoxyd. Zur quantitativen Bestimmung wird schließlich die Anwendung der Desoxyzucker-Reaktion mit Xanthydrol oder eines neuen Butenolid-Verfahrens mit m-Dinitrobenzol empfohlen. Die Leistungsfähigkeit der Methodik wird an Hand von Digitoxin-Bestimmungen in 17 verschiedenen Geweben und Ausscheidungen demonstriert. Hervorzuheben sind die Einfachheit der Methodik sowie die Spezifität und Empfindlichkeit (0,1 μg Digitoxin) der Xanthydrol-Reaktion.

Glycosidation of Chlormadinol Acetate Alters its Actions on Na+/K+-Transporting ATPase and Cardiac Contractility: A Contribution to the Endogenous Digitalis Problem

Compared to the progesterone derivative chlormadinol acetate 1, the arabinofuranoside 2, rhamnoside 3 and glucoside 4 of 1 are less potent in the Na/K-ATPase assay, but evoke, contrary to 1, positive inotropy in vivo. In anaesthetized cats the circulation effects of 2 and 3 appear to be more favourable than those of the digitalis glycoside digitoxin. Hence, the progestin 1 is transformed through glycosidation into an interesting cardioactive steroid.