Nils Averesch

Production of aromatics in Saccharomyces cerevisiae-a feasibility study

Aromatics are amongst the most important bulk feedstocks for the chemical industry, however, no viable bioprocess exists today and production is still dependent on petro-chemistry. In this article the production of aromatic precursors such as p-hydroxybenzoic acid (PHBA) and p-amino benzoic acid (PABA) in Saccharomyces cerevisiae was evaluated using metabolic network analysis. Theoretical mass yields for PHBA and for PABA obtained by metabolic network analysis were 0.58 and 0.53 g g(glucose)⁻¹, respectively. A major setback for microbial production of aromatics is the high toxicity of the products. Therefore, PHBA and PABA toxicity was evaluated in S. cerevisiae. Minimal inhibitory concentrations of 38.3 g L⁻¹ for PHBA and 0.62 g L⁻¹ for PABA were observed. However, PABA toxicity could be alleviated in adaptation experiments. Finally, metabolic engineering was used to create proof of principle first generation strains of S. cerevisiae. Overall accumulation of 650 μM PHBA and 250 μM PABA could be achieved.

In vivo instability of chorismate causes substrate loss during fermentative production of aromatics

Metabolic engineering of microbial strains to produce aromatic compounds deriving from the shikimate pathway is of great interest to the chemical industry as a more sustainable alternative for feedstock production. Chorismate is a significant intermediate in the shikimate pathway. In this study, the formation of phenylalanine and phenylpyruvate as by‐products in strains engineered downstream of the chorismate node for increased aromatic production was explored in yeast fermentations. Tracer experiments showed that these compounds are synthesized de novo during fermentation, under conditions in which their synthesis was genetically blocked. Chorismate stability evaluation, as well as deletion mutation analysis throughout the phenylalanine biosynthesis pathway, suggested that this synthesis was a result of intracellular, non‐enzymatic rearrangement of chorismate to phenylpyruvate via prephenate, which was followed by enzymatic transamination of phenylpyruvate to form phenylalanine. These results not only aid in the development of strain‐engineering strategies to avoid the accumulation of by‐products during fermentations aimed at increased aromatics production, but also deepen our understanding of yeast metabolism. Copyright

Quantitative analysis of aromatics for synthetic biology using liquid chromatography

The replacement of petrochemical aromatics with bio‐based molecules is a key area of current biotechnology research. To date, a small number of aromatics have been produced by recombinant bacteria in laboratory scale while industrial production still requires further strain development. While each study includes some distinct analytical methodology to quantify certain aromatics, a method that can reliably quantify a great number of aromatic products and relevant pathway intermediates is needed to accelerate strain development. In this study, we developed a robust reverse phase high performance liquid chromatography method to quantify a wide range of aromatic metabolites present in host microorganisms using the shikimate pathway, which is the major metabolic pathway for biosynthesis of aromatics. Twenty‐three metabolites can be quantified precisely with the optimized method using standard HPLC equipment and UV detection, with the mobile phase used for chromatography also compatible with mass spectrometry (MS). The limit of quantification/detection is as low as 10−10 to 10−13 mol, respectively, which makes this method feasible for quantification of intracellular metabolites. This method covers most metabolic routes for aromatics biosynthesis, it is inexpensive, robust, simple, precise and sensitive, and has been demonstrated on cell extracts from S. cerevisiae genetically engineered to overproduce aromatics.

Toward Synthetic Biology Strategies for Adipic Acid Production: An in Silico Tool for Combined Thermodynamics and Stoichiometric Analysis of Metabolic Networks

Adipic acid, a nylon-6,6 precursor, has recently gained popularity in synthetic biology. Here, 16 different production routes to adipic acid were evaluated using a novel tool for network-embedded thermodynamic analysis of elementary flux modes. The tool distinguishes between thermodynamically feasible and infeasible modes under determined metabolite concentrations, allowing the thermodynamic feasibility of theoretical yields to be assessed. Further, patterns that always caused infeasible flux distributions were identified, which will aid the development of tailored strain design. A review of cellular efflux mechanisms revealed that significant accumulation of extracellular product is only possible if coupled with ATP hydrolysis. A stoichiometric analysis demonstrated that the maximum theoretical product carbon yield heavily depends on the metabolic route, ranging from 32 to 99% on glucose and/or palmitate in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae metabolic models. Equally important, metabolite concentrations appeared to be thermodynamically restricted in several pathways. Consequently, the number of thermodynamically feasible flux distributions was reduced, in some cases even rendering whole pathways infeasible, highlighting the importance of pathway choice. Only routes based on the shikimate pathway were thermodynamically favorable over a large concentration and pH range. The low pH capability of S. cerevisiae shifted the thermodynamic equilibrium of some pathways toward product formation. One identified infeasible-pattern revealed that the reversibility of the mitochondrial malate dehydrogenase contradicted the current state of knowledge, which imposes a major restriction on the metabolism of S. cerevisiae. Finally, the evaluation of industrially relevant constraints revealed that two shikimate pathway-based routes in E. coli were the most robust.

Metabolic Network Analysis of Microbial Methane Utilization for Biomass Formation and Upgrading to Bio-Fuels

The potent greenhouse gas methane presents a widely accessible resource, being the primary component in natural gas as well as in bio-gas from anaerobic digesters. Given its relatively low heating-value and several issues concerning its storage and transportation, methane upgrading to liquid fuels is of particular interest. Microbial methane conversion/utilization and upgrading is gaining increasing interest due to its high conversion efficiency. In this study we computationally compare aerobic and anaerobic microbial pathways for CH4 oxidation and discuss theoretically achievable biomass yields as well as the possibility for building synthetic biological production platforms for liquid fuels. Specifically, the presented in-silico work investigates the potential of microbial methane upgrading in a metabolic network analysis by means of elementary flux modes. Aerobic fixation of methane via conversion of methane to methanol by a methane monooxygenase (MMO) and different subsequent formaldehyde assimilation pathways (Serine-cycle, RuMP, XMP/DHA-pathway) is compared with anaerobic pathways for oxidation of methane (AOM) by means of reverse-methanogenesis or via a presumed glycyl-radical enzyme, which uses fumarate for activation of methane. The different pathways for aerobic and anaerobic methane oxidation are compared in different central carbon-metabolism envelopes in order to identify highest achievable carbon yields. The capability of efficient CO2 fixation, as well as energy preservation in form of reducing equivalents is identified as crucial to enable high yields, which ranged from 22% to 100%. The potential of the different microbes to grow on these gas streams is assessed by means of the maximum achievable biomass yield and the CO2/CH4 uptake ratio. CO2 co-utilisation, by transferring reducing power between the two co-substrates, is highest, when combining reverse-methanogenesis with the Wood-Ljungdahl pathway, effectively replacing the need for H2 with CH4. Further, the possibility to upgrade methane into liquid (drop-in) bio-fuels is investigated. Established routes to methanol, ethanol, C4-alcoholes and farnesene are evaluated in the most promising substrate-pathway / organism combinations. Stoichiometric, thermodynamic and kinetic limitations are assessed and recommendations regarding potential industrial feasibility are given. The results presented here should guide future research efforts in search for feasible ways of (co)utilizing novel carbon substrates for sustainable production of fuels and chemicals.

Kapitel 9: Terpenoide

Terpene sind Naturstoffe, deren Name sich aus der Geschichte der Naturstoffchemie ableitet. Die Namensgebung ist dabei zum Teil unterschiedlich: Neben der heute gebrauchlisten Bezeichnung als Terpenoide werden auch die Bezeichnungen Isoprenoide oder Terpene verwendet. Dies hat historische Grunde, die ezeichnung „Terpene“ leitet sich z. B. von dem Vorschlag des Chemikers Friedrich A. Kekule ab, diese Naturstoffgruppe nach dem Baumharz der Kiefer (Pinus sylvestris) zu benennen, aus welcher durch Destillation das Terpentinol gewonnen wird. Terpentinol ist somit nicht ein petrochemisches, sondern ein naturliches Ol, das hauptsachlich 2-Pinen, 2,10-Pinen und 3-Caren enthalt. Terpene bestehen ausschlieslich aus Kohlenstoffen.

Kapitel 8: Phenole und Phenylpropane

Phenole sind aromatische Naturstoffe, bei denen mindestens ein aromatisches Proton durch eine Hydroxylgruppe ausgetauscht ist. Nach der Anzahl der Hydroxylgruppen wird zwischen ein-, zwei-, drei- oder mehrwertigen Phenolen unterschieden. Neben freien Hydroxylgruppen konnen diese auch als O-Prenyl- oder Methoxygruppe vorhanden sein. Sehr haufig liegen phenolische Aromaten als Aldehyd (z. B. Vanillin) oder Saure (z. B. Benzoesaure) vor. Durch strukturelle Variationen konnen physikalisch-chemische Eigenschaften stark beeinflusst werden, die weitere Biosynthesen durch diese Precursor pragen. Die meisten Aromaten werden durch den Shikimisaureweg biosynthetisiert. Eine weitere Variante ist der Polyketidweg und ein dritter Weg lauft uber die Terpenbiosynthese, hier spielen aber nur Gossypol, Thymol und Estrogen untergeordente Rollen und sollen auch nicht weiter diskutiert werden. Phenolische Naturstoffe sind pragend fur das Pflanzenreich und kommen entweder frei oder gebunden an Zucker vor (Phenolglykoside). Freie Phenole sind auch in petrochemischen Produkten, atherischen Olen und Harzen zu finden, wie spater noch diskutiert wird.

Kapitel 6: Acetatbiosynthese / Polyketidbiosynthese

Naturstoffe, die aus C 2 Einheiten(Acetyl- CoA) oder C 3 Einheiten (Malonyl-CoA) aufgebaut sind, fallen unter die sogenannte Acetatregel. Bei dieser Art von molekularen Verknupfungen sind haufig alternierende (meta-standige) Ketogruppen zu finden, die auf Acetatbausteine zuruckzufuhren sind (Acetatregel). Aromatische Naturstoffe, die aus diesem Biosyntheseweg hervorgehen, sind durch zueinander β-standige Hydroxylgruppen gekennzeichnet, wenn sie nicht durch den Ringschluss auf Grund einer intramolekularen Aldol- oder Claisen- Reaktionen zugunsten einer C-C Verknupfung eliminert wurden (siehe unten). Obwohl theoretisch eine beliebige Zahl von Verknupfungen der C 2 Einheiten denkbar ist, zeigt sich, dass in der Natur dieses Potenzial nur begrenzt ausgenutzt wird. Molekulgewichte bedeutender Naturstoffe zeigen, dass Acetate haufig aus 4 bis 20 Einheiten aufgebaut sind. Die wichtigsten Vertreter konnen in zwei Gruppen zusammengefasst werden, die Fettsauren und die Polyketide.

Kapitel 5: Kohlenhydrate

Kohlenhydrate sind mehrwertige Alkohole mit einer Aldehyd- oder Ketofunktion, die in der Umgangssprache als Zucker oder Saccharide bezeichnet werden. Als „Hydrate des Kohlenstoffs“ leitet sich ihr Name von dem empirischen Verhaltnis von C zu H zu O von 1 : 2 : 1 ab, das einer Summenformel von Cn(H2O)n entsprechen wurde. In ihrer Biosynthese sind neben der Glucose aus der Photosynthese alle weiteren Zucker Folgeprodukte, die uber den Pentosephosphatweg in weitere Zucker umgebaut, bzw. zu polymeren Zuckern, wie z. B. Starke oder Glykogen, kondensiert werden. Kohlenhydrate gehoren zu den wichtigsten Quellen- und Speicherstoffen von Energie in fast allen lebenden Organismen. Die Beschreibung der Photosynthese, in welcher der Grundzucker Glucose hergestellt wird, erfolgte bereits im Detail in Kapitel 1, und eine genauere Betrachtung der Verstoffwechslung der Glucose in Glykolyse und Zitronensaurezyklus in Kapitel 2. In diesem Kapitel sei noch einmal hervorgehoben, dass in der Photosynthese nicht die Glucose an sich, sondern die aktivierte Form Glucose-1,6-Diphosphat als biochemisch aktivierter Zucker geschaffen wird. Dieses Diphosphat wird zu Glucose-1-Phosphat dephosphoryliert und zu Glucose-6-Phosphat isomerisiert, welches nun das Ausgangsmolekul fur die Biosynthese von Mono-, Oligo- und Polysacchariden ist (Abb. 5.1). Wichtig ist auch das Verstandnis der tiefgreifende Bedeutung der Glucose uber die Glykolyse als biochemischer Ausgangsstoff fur weitere Biosynthesewege (siehe Abb. 5.2). Durch die starke Vernetzung und Verzweigungen dieser Stoffwechselwege wird erst die fast universelle Bedeutung.

Kapitel 4: Bausteine der Biosynthese

Fast alle Naturstoffe* sind aus einheitlichen biosynthetischen Bausteinen aufgebaut, man ist fast geneigt zu sagen, dass sie einem „Lego-Prinzip“ folgen. Dass das nicht stimmt und in der Natur eine sehr hohe strukturelle Diversitat zu finden ist, hat mit der „Promiskuitat“ von Enzymen und der Kombination von biosynthetischen Routen zu tun, die nicht immer strikt kompartimentiert sind. Diese Kombination von Chemie und Biologie und sicherlich auch der Zufall fuhrten im Laufe der Evolution zu der chemotaxonomischen Vielfalt, die bereits angesprochen wurde. Deutlich wird dies, wenn Naturstoffe mariner Organismen untersucht werden. Da Chlorid und Bromid im Wasser gelost frei verfugbar sind, ist es nicht verwunderlich, dass halogenierte Naturstoffe, welche ein Brom oder Chlor als Substituent tragen, haufig vorkommen. Im Gegensatz zur marinen chemischen Vielfalt sind halogenierte Naturstoffe bei Landpflanzen eine echte Raritat.