Otto Westphal

Über die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser

Es werden zwei einfache Verfahren zur Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser angegeben. Nach Behandlung von gramnegativen Bakterien mit Phenol/Wasser-Emulsionen in der Kälte während weniger Minuten erhält man in der wäßrigen Phase die somatischen Glykoproteide der Bakterien (hauptsächlich 0-Antigene) in praktisch quantitativer Ausbeute. Nach Extraktion der Bakterien mit erwärmten, homogenen Phenol/Wasser-Mischungen und Trennen der Phasen in der Kälte finden sich in der wäßrigen Phase die proteinfreien Polysaccharide neben Nucleinsäuren. Einige chemische und immunologische Eigenschaften der nach den beiden Verfahren dargestellten Glykoproteide und Polysaccharide werden beschrieben.

Synthesis and antigenic properties of sugar-polypeptide conjugates

Abstract The coupling of the diazotization product of p- aminophenyl -β- d - galactopyranoside with the synthetic polypeptide antigen p( l -Glu, l -Tyr)-p- dl -Ala-p- l -Lys resulted in a conjugate which elicited in rabbits antibodies with galactose specificity. While the total amount of antibodies formed was much smaller than that formed by a similar galactose derivative of bovine serum albumin, the galactose specificity in the synthetic conjugate system was much higher than in the protein conjugate system. In order to avoid linkage of sugar derivatives to synthetic polypeptides through tyrosine, glucose was bound to p( l -Glu, l -Tyr)-p- dl -Ala-p- l -Lys and to the non-antigenic p- dl -Ala-p- l -Lys by making use of O-( tetra -O- acetyl -β- d - glucopyranosyl )-N- carboxy - l - serine anhydride. Antibodies with glucose specificity were obtained upon immunization with p- d -Glc- l -Ser-p( l -Glu, l -Tyr)-p- dl -Ala-p- l -Lys, but no immune response was detected in rabbits injected with two samples of p- d -Glc- l -Ser-p- dl -Ala-p- l -Lys. As was to be expected, a monosaccharide attached to protein contributes to serological specificity but it does not convert the non-antigenic p- dl -ALA-p- l -Lys into an immunogen.

The Story of Bacterial Endotoxin

SUMMARY After the introduction of the term bacterial endotoxin early this century by Richard Pfeiffer, about 80 years elapsed until this biologically omnipotent and highly active principle could be chemically clearly defined. Endotoxin was found to reside in the lipopolysaccharide (LPS) of the bacterial cell envelope; it was then pinpointed as the lipid component of LPS, called lipid A . This lipid has an unusual structure - with certain variations on a characteristic backbone - which does not seem to exist anywhere else in nature. After the elucidation of the structure of some lipid As ( E. coli , Salmonella and others) it became more recently possible to identify the pathway of lipid A biosynthesis and to fully synthesize lipid A of E . coli . The synthetic product is chemically, physico-chemically and biologically identical with its natural lipid A prototype. With these achievements the old question as to the structure(s) responsible for endotoxicity has been solved - and a new chapter of research on endotoxin is open. The following review is an extended version of a lecture given by O.W. on May 7, 1985 at the 3rd International Conference on Immunopharmacology in Florence, Italy.

CHAPTER 1 – Microbial Polysaccharides*

Publisher Summary Microbial polysaccharides are located on the cell surface and are of importance in recognition and immune response of a higher organism to microbial infection. These polysaccharides are either an integral part of the cell wall, as this is known to be the case with the somatic lipopolysaccharides of Gram-negative Enterobacteriaceae, or they might form large extracellular capsules like those of Pneumococcus, Klebsiella, and Escherichia coli. Polysaccharides of microorganisms can be pure polysaccharides or complex ones. The most prominent and best studied complex polysaccharides are the somatic lipopolysaccharides. It was found that most microbial polysaccharides cannot be digested by mammalian enzymes so that they remain in the circulation and tissue for a long time. This became an important aspect in the immune response to microbial polysaccharides. Antigenic specificity and the antigen-antibody reaction were analyzed, which led to a better understanding of immunodominant sugars and antigenic determinants. This chapter reviews the present state of microbial polysaccharide immunology.

Über bakterielle Reizstoffe

ZusammenfassungEs wird über Ergebnisse von vergleichenden experimentellen Untersuchungen über die Wirkungsweise von bakterieller Vaccine, hochgereinigten wasserlöslichen bakteriellen Polysacharid-Pyrogenen und acetylierten Bakterien-Polysacchariden aus gramnegativen Keimen berichtet. Zur Differenzierung der therapeutischen Wirkungen der 3 Reizstofftypen wurden in Reizstoffversuchen an gesunden Versuchspersonen die Reaktionserscheinungen des Fiebers, des weißen Blutbildes und die Uropepsinschwankungen verfolgt und charakteristische Wirkungsunterschiede gefunden. In tierexperimentellen Untersuchungen an der Ratte konnten die beobachteten Wirkungsunterschiede durch den Nachweis entsprechender morphologischer Veränderungen in der Nebennierenrinde bestätigt werden. Aus den experimentellen Ergebnissen wurden die entsprechenden klinischen Schlußfolgerungen hinsichtlich der Anwendung bakterieller Reizstoffe für die Reizkörpertherapie gezogen.Es wird uber Ergebnisse von vergleichenden experimentellen Untersuchungen uber die Wirkungsweise von bakterieller Vaccine, hochgereinigten wasserloslichen bakteriellen Polysacharid-Pyrogenen und acetylierten Bakterien-Polysacchariden aus gramnegativen Keimen berichtet. Zur Differenzierung der therapeutischen Wirkungen der 3 Reizstofftypen wurden in Reizstoffversuchen an gesunden Versuchspersonen die Reaktionserscheinungen des Fiebers, des weisen Blutbildes und die Uropepsinschwankungen verfolgt und charakteristische Wirkungsunterschiede gefunden. In tierexperimentellen Untersuchungen an der Ratte konnten die beobachteten Wirkungsunterschiede durch den Nachweis entsprechender morphologischer Veranderungen in der Nebennierenrinde bestatigt werden. Aus den experimentellen Ergebnissen wurden die entsprechenden klinischen Schlusfolgerungen hinsichtlich der Anwendung bakterieller Reizstoffe fur die Reizkorpertherapie gezogen.

Age-related changes in interleukin production in BALB/cNNia and SJL/J mice and their modification after administration of foreign macromolecules

In vitro production of Interleukin-2, -3, -4 and -10 by activated lymphocytes of BALB/cNNia and SJL/J was studied. While IL-2 production in BALB/c mice remains constant throughout the life span of the animals (8-113 weeks), an increase in production from stimulated SJL cells was seen. Age-related increases in IL-3 and IL-4 production occur between young and middle age (8-60 weeks) in both strains. Some organ differences in quantity of lymphokine produced were seen; the direction of age-related changes was the same for lymphocytes of spleen and MLN. The exceptional feature of BALB/cNNia was the relative stabilization of the levels of interleukin production, as animals approach old age. BALB/cNNia and SJL, which are at the two opposite extremes of lifespan, differ also in their response to molecular interventions: in BALB/cNNia fetal sheep liver extract and hemocyanin increase the output of interleukins. This is in striking contrast to the effects observed in older SJL mice in which the extract reduced the output of IL-3 and IL-4 by old animals, whereas hemocyanin increased the output of IL-2 and IL-3 at all ages tested.

Die biologische Bedeutung der chemischen Feinstruktur bakterieller Zellgrenzflchen

In den letzten Jahren haben sich unsere Kenntnisse fiber den Aufbau von Bakterien und die WechseIwirkungen bakterieller Inhaltsstoffe mit der Umgebung -auch beim Infekt -wesentlich vertieft. Diese Fortschritte basieren vor allem auf der Verbesserung mikroskopischer Techniken, insbesondere durch das Elektronenmikroskop, sowie auf verbesserten Verfahren, einzelne zellul~re Elemente pr~parativ zu isolieren und ihre Struktur mit modernen chemisehen Mitteln zu analysieren. Bei der Auseinandersetzung yon Bakterien mit dem hSheren Organismus im Verlauf yon Infekten kommt der bakteriellen Zellgrenzfl~tche vielfach eine besondere Bedeutung zu. Elemente, die hier interessieren, sind u.a. bakterielle Kapseln, Zellwiinde und Membranen.

Über bakterielle Reizstoffe I. Mitt.: Reindarstellung eines Polysaccharid-Pyrogens aus Bacterium coli

Aus Colibakterien (Stamm Kröger 0- Gruppe 8) wurde ein hochwirksames Pyrogen dargestellt. Die Bakterien wurden mit Phenol/Wasser extrahiert (Verfahren nach Westphal, Lüderitz u. Bister), die erhaltene wäßrige Lösung der Polysaccharid/ Nucleinsäure-Fraktion wurde zur Entfernung der Nucleinsäure mehrfach mit Äthanol fraktioniert; aus der so gewonnenen angereicherten Polysaccharid-Fraktion konnte durch Ultrazentrifugation das reine Pyrogen in einer Ausbeute von 1-2% der bakteriellen Trockensubstanz als Sediment abgetrennt werden. Es handelt sich um ein hochmolekulares, wasserlösliches Lipopolysaccharid, welches zu ~ 75% aus einer phosphorylierten (6-7% organisch gebundenes Phosphat) Polysaccharid-Komponente und zu 12-13% (Minimalwert) aus einer lipoidalen Komponente aufgebaut ist. Das Material ist frei von Protein-, Peptid- oder Aminosäure-Anteilen sowie von Nucleinsäure. Die pyrogene Grenzdosis nach intravenöser Injektion beim Kaninchen beträgt 0,002 μg, kg, beim Menschen 0,001 μg/kg. Es handelt sich um das bislang wirksamste Pyrogen, welches aus gramnegativen Bakterien isoliert werden konnte.

Papierelektrophorese bei hohen Spannungen zur Trennung von Peptiden

Die Papierelektrophorese bei hohen Spannungen wurde zur Trennung von definierten niederen Peptiden angewandt, wobei mit Spannungsgefällen bis zu 120 Volt/cm gearbeitet wurde. Es konnte gezeigt werden, daß auf diese Weise wirksame Trennungen chemisch nahe verwandter Peptide in 1—2 Stdn. erzielt werden können. Auch an natürlichen Peptidgemischen aus Urin und Protein-Partialhydrolysaten konnte die Wirksamkeit der Methode demonstriert werden.

Restoration of the responsiveness to growth factors in senescent cells by an embryonic cell extract

In senescent fibroblast cell cultures which have approached a postmitotic stage in vitro, responsiveness to growth factors is restored upon exposure to an embryonic sheep cell extract. The extract contains molecules below a molecular weight of 1 x 10(5) Da in aqueous solution. Following a transient exposure to the extract, mitotic activity is resumed, and the cells keep dividing over several passages. The target cells which respond to the treatment were identified in a single-cell assay as those that still had the capacity to undergo at least several mitotic divisions before entering the final stage of senescence.