R. Fischer

On the histochemical demonstration of oxidative enzymes in oncocytes of different organs

In den Onkocyten verschiedener drüsig-epithelialer Organe des Menschen [Speicheldrüsen, Schilddrüse (Askanazy-Zellen), Parathyreoidea (Welshsche Zellen)] wurde histochemisch eine starke Aktivität der Cytochromoxydase, der Bernsteinsäure-Dehydrogenase sowie der DPN- und TPN-Diaphorase nachgewiesen. Ein entsprechendes enzymhistochemisches Verhalten zeigten auch die Onkocyten in herdförmigen Hyperplasien im Bereich der Speicheldrüsen sowie die Tumorzellen von zwei Onkocytomen der Schilddrüse (sog. Hürthlezell-Tumoren). Die onkocytär umgewandelten Epithelzellen wiesen stets eine bedeutend stärkere Enzymaktivität auf als die entsprechenden „normalen“ Nachbarzellen. Es bleibt noch unentschieden, ob es sich bei dieser starken Aktivität oxydativer Fermente in den Onkocyten um die Zeichen einer echten Funktionssteigerung (im Rahmen einer „Umdifferenzierung?“) handelt, oder nur um den Ausdruck der Kompensation einer Schädigung. The oncocytes of various organs of man [salivary glands, thyroid (Askanazycells), parathyroid (Welsh-cells)] showed a strong activity of histochemically demonstrable cytochrome oxidase, succinic dehydrogenase, DPN- and TPN-diaphorase. The same was the case with the oncocytes of focal hyperplasia in salivary glands as well as in the tumor cells of two oncocytomas of the thyroid gland (so called Hürthle-cell tumors). The epithelial cells transformed into oncocytes showed regularly a considerably stronger enzymatic activity than the corresponding “normal” cells. It still remains undecided whether this strong activity of oxidative enzymes represents a true increase in function, to be regarded as a functional transformation („Umdifferenzierung“) or only a compensation to cellular damage.

Untersuchungen zur Phytohämagglutinin-stimulierten Umwandlung von menschlichen Blutlymphocyten zu blastenartigen Zellen

Bei der Zuchtung von menschlichen weisen Blutzellen unter der Einwirkung eines aus Phaseolus vulgaris extrahierten Phytohamagglutinins entstehen aus den kleinen Blutlymphocyten grose „blasten“artige Zellen, die sich mitotisch vermehren. Zu ihren wichtigsten Merkmalen aufgrund farberischer, baustein- und enzymcytochemischer Analyse gehoren: ein ausgepragt basophiles Cytoplasma mit groben sudanophilen Granula; ein locker strukturierter Zellkern und sehr grose Nucleoli; eine deutliche ATPase-Aktivitat an den Zellsaumen; eine in vereinzelten Zellen auftretende starker positive Reaktion der sauren Phosphatase (Azofarbstoffmethode). — Bei phasenkontrastmikroskopischer Lebendbeobachtung zeigen die phytohamagglutinin-stimulierten Zellen eine verstarkte, sehr lebhafte Cytoplasmamotilitat zugleich mit einer Neigung, sich mittels eines basalen Portsatzes an ein Substrat anzuheften.Bei der Züchtung von menschlichen weißen Blutzellen unter der Einwirkung eines aus Phaseolus vulgaris extrahierten Phytohämagglutinins entstehen aus den kleinen Blutlymphocyten große „blasten“artige Zellen, die sich mitotisch vermehren. Zu ihren wichtigsten Merkmalen aufgrund färberischer, baustein- und enzymcytochemischer Analyse gehören: ein ausgeprägt basophiles Cytoplasma mit groben sudanophilen Granula; ein locker strukturierter Zellkern und sehr große Nucleoli; eine deutliche ATPase-Aktivität an den Zellsäumen; eine in vereinzelten Zellen auftretende stärker positive Reaktion der sauren Phosphatase (Azofarbstoffmethode). — Bei phasenkontrastmikroskopischer Lebendbeobachtung zeigen die phytohämagglutinin-stimulierten Zellen eine verstärkte, sehr lebhafte Cytoplasmamotilität zugleich mit einer Neigung, sich mittels eines basalen Portsatzes an ein Substrat anzuheften. Die Kultivierungsversuche beweisen, daß der Blutlymphocyt nicht eine Endstufe ohne Entwicklungspotenz ist, sondern vielmehr eine Zellform mit ausgeprägter Transformationsfähigkeit. Die besondere Art der Umwandlung des kleinen Lymphocyten zu der „blasten“ artigen Zelle dürfte einer Aktivierung entsprechen, wie sie offenbar auch unter einem antigenen Stimulus hervorgerufen werden kann. Die aktivierten Zellen der Kultur besitzen eine große Ähnlichkeit mit den sog. basophilen Stammzellen und gewissen Plasmazellvorstufen im lymphatischen Gewebe. Es wird die Möglichkeit erörtert, daß es sich bei diesen Zellformen um aktivierte Lymphocyten handeln könnte. When human white blood cells are cultured in vitro in the presence of phytohemagglutinin extracted from Phaseolus vulgaris, large “blast-like” cells develop from the small lymphocytes and divide mitotically. From the analyses of their staining properties and enzyme-cytochemical behavior their most important characteristics may be stated as: a pronounced basophilic cytoplasm with coarse sudanophilic granules, a loosely structured nucleus, very large nucleoli, a distinct ATPase activity at the cell borders, and a strongly positive acid phosphatase reaction in individual cells (azo-dye method). Phase microscopic studies of living cells stimulated with phytohemagglutinin reveal an increased and very lively motility of the cytoplasm. At the same time the cells show a tendency to adhere to a substrate by means of a basal process. The experiments on the cultures indicate, that the blood lymphocyte is not an end-stage cell without developmental potentialities, but rather a type of cell possessing obvious abilities to undergo transformation. The distinct type of change of the small lymphocyte to the “blast-like” form may well correspond to an activation, as it apparently may also be called forth by an antigenic stimulus. The activated cells of the culture are very similar to the socalled basophilic stem cells (hyperbasophilic cells) and certain plasma cell precursors found in lymphatic tissue. The possibility is discussed, that these cell forms may represent activated lymphocytes.

Ergebnisse der Züchtung von Lymphocyten in vitro

Zusammenfassendist hervorzuheben, daß wir mit den modernen Methoden der Züchtung in vitro den Lymphocyten, in Bestätigung mancher alten Befunde vor allem vonMaximow [47] sowieAwrorow u.Timofejewski [6], als eine Zellart zu betrachten haben, die eine auffällige und variable morphogenetische Transformationsfähigkeit besitzt. Bei einer Vielzahl von Einzelbefunden ergibt sich eine zunehmende Klarheit vor allem über ihre Transformationsfähigkeit im Zusammenhang mit immunocytologischen Prozessen. Viele Probleme sind noch offen oder stehen erneut zur Diskussion, vor allem diejenigen zur Wechselbeziehung zwischen Lymphocyten und Histiocyten; die Frage der exakten Beziehung zwischen den Immunocyten bzw. Immunoblasten und den Plasmazellen; viele Fragen der Immunocytologie, darunter diejenige, wie der Begriff der Kompetenz in einem cytologischen Sinne zu definieren ist. Schließlich bestehen — wovon hier nicht die Rede sein konnte — große Fragen der Reaktionsfähigkeit der Thymuslymphocyten im Vergleich zu den Lymphocyten der lymphatischen Organe und des Blutes.SummaryThe conditions of cultivating lymphocytes in vitro and the results on their Phytohaemagglutinin induced blastoid transformation are summarized. The cytological findings are supplemented by observations on living cells made with phase contrast microscopy. The most outstanding features in the course of blastoid transformation seem to be an increase in cellular, nuclear and nucleolar size, as well as the acquisition of a considerable cytoplasmic basophilia and a marked increase of cellular and cell membrane motility. Together with this latter phenomenon a characteristic tendency of adhesion to a surface substratum by means of a foot appendage is evident. Rosette formation and cellular association of lymphocytes and monocytes could be explained by these observations.Phytohaemagglutinin stimulation of lymphocytes is a model for antigen induced blastoid transformation of competent lymphocytes. The results on antigenic lymphocyte stimulation in vitro are reviewed. In discussing the importance of blastoid transformation it is emphasized that the lymphocytic stimulation is the expression of an immuno-cytologic reaction. Thus, there is some reason to interpret the blastoid cells as immunocytes or immunoblasts. This opinion can be stressed by comparing blastoid cells observed in vitro with hyperbasophilic cells or with the so-called plasmacell-precursors in chronic inflammation or allergic disease. Furthermore results on mixed lymphocyte reaction (M.L.R.) are presented.Lymphocyte response in vitro to Phytohaemagglutinin is diminished or even missing in lymphoproliferative diseases. The reasons for this deficiency are not yet clearly elucidated.There is much difference of opinion on the fate and properties of lymphocytes cultivated in vitro in the absence of Phytohaemagglutinin or antigenic stimulation. The assertion that macrophages and multinucleated giant cells originate by a “histiocytic” transformation of lymphocytes rather than from monocytes is not generally supported. More data on this problem have to be gathered.

Cytologische und cytochemische Untersuchungen an normalen und leukämischen in vitro gezüchteten Blutzellen

ZusammenfassungBei der Züchtung von normalen weißen Blutzellen des peripheren Venenblutes mit und ohne Zusatz eines aus Bohnen extrahierbaren Phytohämagglutinins (Phaseolin) kommt es zu einer unterschiedlichen Umwandlung der kleinen Lymphocyten: Unter der Einwirkung von Phaseolin entstehen aus den kleinen Lymphocyten in wenigen Tagen große „blasten“ artige proliferationsfähige Zellen, die cytochemisch etwa das gleiche Muster der Enzymausstattung aufweisen wie die zu Beginn der Züchtung vorhandenen kleinen Lymphocyten; nur die verschiedenen oxydativen Enzyme ergaben einen verstärkten Reaktionsausfall.Bei Abwesenheit von Phaseolin wandeln sich die kleinen Lymphocyten über lymphocytenähnliche Übergangsformen in histiocytäre Zellformen um. Sie gehen schließlich gemeinsam mit den zahlenmäßig stark zurücktretenden monocytären Zellen in einen gleichartigen Typ histiocytärer und epitheloider Zellen sowie Riesenzellen über. Im Verlaufe dieser Transformationsvorgänge ist die Umwandlung der kleinen Lymphocyten zu histiocytären Zellen mit einer Vermehrung einer Reihe von Enzymen verbunden, besonders deutlich erkennbar an der Aktivitätszunahme der Naphthol-AS-Acetat-Esterase und der sauren Phosphatase. Diese Ergebnisse werden bestätigt durch Versuche mit kurzfristiger Einwirkung von Phytohämagglutinin am Anfang der Züchtung sowie durch Versuche mit Phaseolinzugabe nach mehrtägiger Züchtungsdauer.Bei der Züchtung von leukämischen Blutzellen (4 chronische Lymphadenosen, 1 Monocytenleukämie vom Typ Schilling, 1 chronische Myelose) kommt es unter der Einwirkung von Phaseolin zu einer deutlichen Zellvermehrung. Bei den vier untersuchten Lymphadenosen war eine unterschiedliche Transformationsfähigkeit der lymphatischen Zellen nachweisbar. Sie fehlte teils ganz, teils war sie annäherungsweise mit derjenigen normaler Lymphocyten vergleichbar.SummaryIn the cultivation of normal blood cells of the peripheral venous blood, with and without the addition of a Phytohaemagglutinin (Phaseolin), extractable from beans, a variable change of the small lymphocytes can be observed; Following the influence of Phaseolin, large “blast” like cells with an ability to proliferate develop within a few days from the small lymphocytes, which shows an identical histochemical pattern of enzymes as the small lymphocytes present at the beginning of the culture; only the various oxydative enzymes showed a stronger reaction.In the absence of Phaseolin the small lymphocytes change over lymphocyte-like transition stages to a histiocytic cell form. Along with a numerically smaller amount of monocytic cells they finally pass over into a similar type of histiocytic epitheloid cells as well as giant cells. In the course of these transformation processes the change of the small lymphocytes to histiocytic cells is connected with an increase of a number of enzymes which can be distinctively recognized in an increased activity of the Naphthol AS-acetate-esterase and the acid phosphatase. These results are confirmed by experiments with a short time influence of Phytohaemagglutinine at the beginning of the culture as well as by experiments with the addition of Phaseolin after several days of cultivation.In the cultivation of leukemic cells (4 cases of chronic lymphadenosis, 1 acute monocytic leukemia, 1 chronic myeloid leukemia) a distinctive increase in cells can be seen following the influence of Phaseolin. In the four cases of lymphadenosis examined a variable capability of transformation of the lymphatic cells could be demonstrated. Being completely absent in some, it could almost be compared to that of normal lymphocytes in other cases.

Zytochemischer Polymorphismus der sauren Phosphatase bei Haarzell-Leukämie

ZusammenfassungMit Hilfe zytochemischer Untersuchungen kann bei der Haarzell-Leukämie ein Polymorphismus der sauren Phosphatase (SP) nachgewiesen werden. In einem von vier untersuchten Fällen fehlt jegliche SP in den Haarzellen, bei zweien ist nur tartratsensible SP nachweisbar, im vierten tartratresistente SP in hoher Aktivität. Nach unseren Erfahrungen spricht das Fehlen tartratresistenter SP nicht gegen die Diagnose Haarzell-Leukämie.SummaryIn four cases of hairy cell leukemia a cytochemical polymorphism concerning acid phosphatase (AP) is evident. Any AP is lacking in all hairy cells of one case; only tartrate inhibitable AP is occurring in two cases; in another case tartrate resistant AP is found in high activity. Thus, the lack of tartrate resistant AP seems not to be an argument against hairy cell leukemia.

Vorkommen von Tartrat-resistenter saurer Phosphatase in verschiedenen Zelltypen des lympho-retikulären und hämopoetischen Systems

Die Tartrat-resis tente saure Phosphatase (TSP) hat als Markerenzym der HaarzellLeukiimie Aufmerksamkei t gefunden. Die biologische Bedeutung dieses Isoenzyms bleibt riitselhaft, solange fiber ein V o r k o m m e n dieses Fermentes in nicht-neoplastischen Zellen wenig bekannt ist. Auch ist nicht eindeutig gekliirt, bei welchen anderen Leukiimiearten TSP auftreten kann. Immerh in haben Yam et al. [9] zumindest biochemisch ger inge Aktivit~iten yon TSP bei verschiedenen Nicht-Haarzell-Leuk~imien erwithnt. Wi t haben daher das Vorhandense in zytochemisch nachweisbarer TSP in nicht-neoplast ischen Zel len yon Knochenmark und Lymphkno ten sowie in Blutausstrichen yon 14 akut und 12 chronisch ver laufenden lymphat ischen Leuk~imien, ferner yon 13 chronischen Myelosen und 8 verschiedenart igen akuten myeloischen Leuk/imien (myelo-monozytitr , promyelozyt~ir, myeloblast~tr) iiberpriift .

Untersuchungen zur enzymhistochemischen Differenzierung von leukämischen Erkrankungen am Schnittpräparat

Am Obduktionsmaterial wurden bei Fallen verschiedener leukamischer Erkrankungen histochemische Untersuchungen zum Nachweis hydrolytischer Enzyme (alkalische und saure Phosphatase, α-Naphthyl- und Naphthol AS-Acetat-Esterase, Naphthol ASD-Chloroacetat-Esterase) durchgefuhrt. Es konnte gezeigt werden, das diese Methoden — ahnlich wie an intravital gewonnenen Ausstrichpraparaten — auch bei der pathologisch-anatomischen Beurteilung von Schnittpraparaten uber die Moglichkeiten der ublichen histologischen und hamatologischen Farbungen hinaus zur Differenzierung der verschiedenen Blut- und Knochenmarkelemente verhelfen und so zur Unterscheidung und Abgrenzung verschiedener Leukamieformen beitragen konnen. Diese Methoden gestatten weiterhin einen Uberblick uber Ausmas und Beteiligung anderer Zellen und Strukturelemente an dem leukamischen Krankheitsprozes.Am Obduktionsmaterial wurden bei Fällen verschiedener leukämischer Erkrankungen histochemische Untersuchungen zum Nachweis hydrolytischer Enzyme (alkalische und saure Phosphatase, α-Naphthyl- und Naphthol AS-Acetat-Esterase, Naphthol ASD-Chloroacetat-Esterase) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß diese Methoden — ähnlich wie an intravital gewonnenen Ausstrichpräparaten — auch bei der pathologisch-anatomischen Beurteilung von Schnittpräparaten über die Möglichkeiten der üblichen histologischen und hämatologischen Färbungen hinaus zur Differenzierung der verschiedenen Blut- und Knochenmarkelemente verhelfen und so zur Unterscheidung und Abgrenzung verschiedener Leukämieformen beitragen können. Diese Methoden gestatten weiterhin einen Überblick über Ausmaß und Beteiligung anderer Zellen und Strukturelemente an dem leukämischen Krankheitsprozeß. Histochemical studies (the demonstration of hydrolytic enzymes: alkaline and acid phosphatase, α-naphthyl- and naphthol AS-acetate esterase, naphthol ASD-chloroacetate esterase) were carried out on autopsy material of various leukemic disorders. It could be shown, that these technics, similar to smears obtained during life, are helpful in the pathological anatomical evaluation of sections in differentiating the various blood and bone marrow elements beyond the commonly applied histological and hematological staining technics. They may, therefore, be of aid in distinguishing and identifying various forms of leukemia. In addition, these technics permit a survey of the extent of the leukemic process and of the involvement of other cells and structural elements.

Cytochemie des Lymphocyten in vitro

SummaryProblems of growth and metabolism in the course of Phytohaemagglutinin and antigen induced blastoid transformation of lymphocytes in vitro are reviewed. Special attention is paid to studies of nucleic acid synthesis and the cytochemistry of carbohydrates, lipids, proteins and enzymes. As far as pertinent results are available the behavior of leukemic lymphocytes is compared with results obtained by the investigation of normal lymphocyte response.Lymphocyte transformation is accompanied by a considerable increase in RNA and DNA synthesis. RNA synthesis already demonstrable in normal lymphocytes is distinctly activated within 24 hours after the onset of the culture. On the contrary DNA synthesis as measured by3H-Thymidine incorporation is detectable only after 24 hours of culture and rises to a maximum of 45–50% labelled nuclei after 72 hours. Cytochemical staining reactions reveal a marked cytoplasmic basophilia and pyroninophilia of the blastoid cells. The cytoplasm contains lipid granules of different size. The blastoid transformation is further characterized by an increase of cytoplasmic hydrolytic enzymes (Acid phosphatase, Naphthol-AS-acetate-esterase, β-Glucuronidase). The significance of these hydrolases in lymphocyte response to Phytohaemagglutinin and antigens is emphasized by the possible relationship of these enzymes to lysosomes. Thiamine-pyrophosphatase activity in blastoid cells is present in the Golgi-zone which by electron microscopic studies is shown to be enlarged in comparison to the non-activated lymphocytes. The increase of ATPase localized on cell borders can be brought in relationship to increased cytoplasmic motility of the blastoid lymphocytic cells. There is also a distinct augmentation of the activity of oxydative and glycolytic enzymes. The importance of these changes of the enzyme cytochemical pattern is stressed by the fact that they accompany the appearance of specific functional qualities of the transformed blastoid lymphocytes. One of the most outstanding metabolic activities displayed by stimulated lymphocytes is the synthesis of specific proteins. Immune histochemical studies have shown that these proteins are partially γ-globulins.Most results emphasize the assumption that Phytohaemagglutinin and antigen induced blastoid transformation of lymphocytes in vitro can best be explained as an immunocytologic reaction.

Eosinophilenleukämie, eine unreifzellige Myelose mit Chloroacetatesterase-positiver Eosinophilie

ZusammenfassungZwei Fälle einer sogenannten Eosinophilenleukämie werden hinsichtlich morphologischer und klinischer Aspekte beschrieben. Dabei handelt es sich um eine spezielle Form akuter Myelosen, die durch folgende Besonderheiten gekennzeichnet ist: hohe Eosinophilie der intra- und teilweise auch extramedullären Infiltrate bei relativ geringer Bluteosinophilie; intra- und extramedulläre Blastenproliferation mit starker Ausschwemmung; kennzeichnende zytochemische Atypien in Form einer ungewöhnlichen Aktivität der Naphthol-AS-D-chloroacetat-esterase und einer stark positiven PAS-Reaktion; besonders elektronenmikroskopisch deutlich sichtbare Dissozation und teilweise Arretierung der eosinophilen Granulogenese. — Die mitgeteilten Fälle zeigen Übereinstimmungen mit anderen, in der Literatur teilweise ebenfalls als “Eosinophilenleukämie” klassifizierten Formen. In diesem Zusammenhang wird die Problematik monophyler Leukosen unter Berücksichtigung der durch die zytochemische Analyse exakt bestimmbaren Differenzierung extramedullärer leukotischer Infiltrate diskutiert.SummaryTwo cases of a so-called eosinophilic leukemia are described with regard to morphological and clinical aspects. These cases are concerning a special variant of acute myelosis characterized by the following items: high eosinophilia of the intra- and in part of the extramedullary infiltrates contrasted by a moderate or low blood eosinophil count; intra- and extramedullary blast cell proliferation with blastic leukocytosis; cytochemical atypism of the eosinophils: unusual naphthol-AS-D-chloroacetatesterase activity, strong PAS-reaction; disarrangement of granulogenesis as revealed by electron microscopy. The presented cases are similar to others, in literature classified as “eosinophilic leukemia”. In this context the problem of monophylic leukemia is discussed in consideration of results obtained by cytochemical analysis of extramedullary leukemic infiltrates.

Der cytochemische Nachweis von Naphthol-AS-D-Chloroacetat-Esterase in Auer-Stäbchen

ZusammenfassungDie in Zellen unreifzelliger neutrophiler Leukämien auftretenden Auer-Stäbchen zeigen cytochemisch eine deutliche, scharf lokalisierte Naphthol-AS-D-Chloracetat-Esteraseaktivität. Dieser Enzymnachweis stellt gerade in zweifelhaften Fällen eine wertvolle Ergänzung zu der Untersuchung an panoptisch gefärbten Blut- und Knochenmarksausstrichen dar. Die vorliegenden Ergebnisse geben einen weiteren Hinweis auf die engen Beziehungen zwischen den Auer-Stäbchen und den cytoplasmatischen Granula unreifer neutrophiler Leukocyten.SummaryAuer bodies, occurring in immature cells of neutrophilic leukemias, show a distinct and well localized cytochemical activity of naphthol-AS-D-chloroacetate-esterase. The evidence of this enzyme represents valuable additional information to the results of panoptic stained blood and bone marrow smears, especially in doubtful cases. The results of this study indicate the close relations between Auer bodies and the cytoplasmic granules of immature neutrophilic leukocytes.