Rudolf Bock

Immunohistochemical demonstration of a CRF-associated neurophysin in the external zone of the rat median eminence

SummaryIn picric acid-formalin fixed, paraplast embedded median eminence sections from normal and bilaterally adrenalectomized rats, the amount of “Gomori-positive” neurosecretory material and the amount of protein, cross reacting against a porcine neurophysin-II antiserum were determined.In normal rats, “Gomori-positive” substances and neurophysin were confined to the internal zone of the median eminence. After adrenalectomy, however, “Gomori-positive” granules and a neurophysin-like protein also became apparent in the external zone. Their amount increases, if the animals are treated with DOCA from the 15th to the 21st day after the operation. The distribution of the neurophysin-like protein in the external zone is similar to that of the “Gomori-positive” granules.Since the granules are regarded as a morphological correlate of the corticotropin-releasing factor (CRF) it is assumed, that the protein, appearing in the external zone after adrenalectomy and cross-reacting against the neurophysin antiserum is a CRF-associated neurophysin. For this substance the name “CRF-neurophysin” is proposed.

Über die Darstellbarkeit neurosekretorischer Substanz mit Chromalaun-Gallocyanin im Supraoptico-hypophysären System beim Hund

SummaryNeurosecretory Substance (NNS) can be demonstrated, after mordant and pre-oxydation of the sections, by using a chromalum-gallocyanine solution in which the molar concentration of chrome and gallocyanine is in the ratio approximately 2∶1. The described staining method is of the exquisite-progressivity type; its results surpass those obtainable by using the chromalum-hematoxylin-phloxin method ofGomori (1941) —Bargmann (1950). The success of the stainung is dependent on the pre-oxydation and mordant of the sections:Without pre-oxydation, using sulphuric-acetic potassium permanganate solution, a demonstration of NSS is not possible.The mordant promotes increase in quantity and colour-intensity of the demonstrable NSS and diminishes the staining-response of nuclear chromatin and Nissl-substance.The diminished stainability of the Nissl-substance and cell nuclei after mordant, would seem to indicate the formation of a chrome-nucleic acid compound that is hard to dissociate.In view of the fact that the chromalum mordant is non-active in a more acid milieu than pH 2 · 5–2, it follows that some other acid group besides the nucleic-acid-phosphate groups must exist in cell nuclei and Nissl-substance, that can be dissociated only in a pH environment above 2-2,5.ZusammenfassungMit einer Chromalaun-Gallocyanin-Lösung, in der sich die molaren Konzentrationen von Chrom und Gallocyanin etwa wie 2∶1 verhalten, läßt sich nach Beizung und Voroxydation der Präparate neurosekretorisches Material färben. Die beschriebene Methode gehört zum Typ der exquisit progressiven Färbungen; das mit ihr zu erzielende färberische Ergebnis übertrifft das der Chromalaun-Hämatoxylin-Phloxin-Methode nachGomori (1941) —Bargmann (1950) deutlich. Der Ausfall der Färbung ist von der Voroxydation und der Beizung der Schnitte abhängig:Ohne Voroxydation mit schwefelsaurer Kaliumpermanganatlösung läßt sich kein Neurosekret darstellen.Die Beizung führt zu einer erheblichen Zunahme der Menge und Farbintensität des darstellbaren neurosekretorischen Materials und zu einer Abnahme der Färbbarkeit von Kernchromatin und Nissl-Substanz.Die Verminderung der Färbbarkeit der Zellkerne und der Nissl-Substanz durch die Beizung wird auf die Bildung einer schwer dissoziierbaren Chrom-Nucleinsäure-Verbindung zurückgeführt. Da die Chromalaun-Beizung in einem saureren Milieu als pH 2,5–2 wirkungslos ist, scheint zur Bildung dieser Verbindung eine saure Gruppe benötigt zu werden, die erst bei pH-Werten über 2–2,5 dissoziiert.

Quantitative Veränderungen „Gomori-positiver” Substanzen in Infundibulum und Hypophysenhinterlappen der Ratte nach Adrenalektomie und Kochsalzoder Durstbelastung

An normalen und bilateral adrenalektomierten Ratten wird der Einfluß von Belastungen des Salz- und Wasserhaushaltes auf die Menge „Gomori-positiver” Substanzen in der Zona externa infundibuli und im Hypophysenhinterlappen untersucht. Die quantitativen Untersuchungen erfolgen an histologischen Präparaten, die nach einer modifizierten Aldehydfuchsin-Methode (Crotonaldehyd-Pararosanilin) gefärbt sind. Bei normalen Ratten enthält die Zona externa infundibuli nur geringe Mengen „Gomori-positiver” Substanzen. Nach bilateraler Adrenalektomie nimmt die Menge dieser Substanzen erheblich zu. Die Substanzmenge wird durch anschließende Durst- oder Kochsalzbelastung wieder vermindert. Die Neurosekretmenge des Hypophysenhinterlappens wird sowohl bei normalen als auch bei adrenalektomierten Ratten durch Durst- oder Kochsalzbelastung reduziert. Die Entleerung des Hypophysenhinterlappens ist bei Normaltieren ausgeprägter als bei adrenalektomierten Tieren. Bezogen auf die Verminderung des Neurosekrets im Hypophysenhinterlappen nehmen die „Gomori-positiven” Substanzen in der Zona externa infundibuli bilateral adrenalektomierter Ratten im Durstversuch stärker ab als bei Kochsalzbelastung. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß die „Gomori-positiven” Granula in der Zona externa infundibuli und im Hypophysenhinterlappen aus verschiedenen aber ähnlichen Substanzen bestehen. Die „Gomori-positiven” Substanzen in der Zona externa infundibuli werden als das morphologische Äquivalent des β-Corticotropin-releasing factor angesehen. In normal and bilaterally adrenalectomized rats the salt and water balance was experimentally changed. The effects of these changes on the amount of “Gomori-positive” substances in the outer layer of the median eminence and in the pituitary posterior lobe were studied. The quantitative studies were carried out on histological preparations stained with a modified aldehyde-fuchsin method (crotonaldehyd-pararosaniline). In the normal rat the outer layer of the median eminence contains only small amounts of “Gomori-positive” substances. After bilateral adrenalectomy there is a marked increase of this granular material. This can be reduced by withdrawal of water or by changes in the salt balance. In normal as well as in adrenalectomized rats the amount of neurosecretory material in the pituitary posterior lobe is also reduced by withdrawal of water or by changes in the salt balance. The reduction of the neurosecretory material in the posterior lobe is greater in normal than in adrenalectomized animals. Compared with the reduction of neurosecretory material in the posterior lobe, the “Gomori-positive” substances in the outer layer of the median eminence of bilaterally adrenalectomized rats are more depleted in thirst than in NaCl-experiments. The results indicate that the granular substances in the outer layer of the median eminence and in the pituitary posterior lobe are very similar although not identical. The “Gomori-positive” substance in the outer layer of the median eminence is regarded as the morphological equivalent of the β-corticotropin-releasing factor.

Färberische Beobachtungen zur Frage nach dem primären Bildungsort von Neurosekret im supraoptico-hypophysären System

SummaryThe development of the neurosecretory hypothalamo-hypophyseal system of mouse and chick embryos has been studied. Neurosecretory granules could be identified in the perikarya of the neurosecretory cells simultaneously with their first appearance in the neurohypophysis.Subsequently, a variety of adult mammalian species was investigated. In all cases, neurosecretory material could be demonstrated along the whole length of the neurons. Comparison of corresponding parts of the neurons showed them to contain comparable amounts of neurosecretory material.The investigations were carried out with improved techniques for staining neurosecretory material. Results of earlier investigations, inconsistent with these findings, were obtained with inadequate methods and cannot be regarded as contradicting the hypothesis of an intraaxonal transport of neurosecretory material.ZusammenfassungAn Embryonen und Jungtieren von Maus und Huhn wurde die Entwicklung des neurosekretorischen hypothalamo-hypophysären Systems untersucht. Dabei gelang es, neurosekretorisches Material in den Perikaryen des Systems zum gleichen Zeitpunkt nachzuweisen, zu dem es in der Neurohypophyse erstmalig auftrat.In vergleichend-anatomischen Untersuchungen an erwachsenen Tieren ließ sich bei einer Reihe von Säugetierarten Neurosekret im Verlauf des gesamten Neurons sichtbar machen. Korrespondierende Neuronabschnitte verschiedener Spezies enthielten dabei vergleichbare Neurosekretmengen.Die Befunde wurden mit verbesserten Verfahren zur färberischen Darstellung von Neurosekret gewonnen. Die von ihnen abweichenden Ergebnisse früherer Untersuchungen beruhen auf unzulänglichen Methoden und können daher nicht gegen die Hypothese eines intraaxonalen Neurosekret-Transportes ins Feld geführt werden.

Fluoreszenzmikroskopische Darstellung Aldehydfuchsin-positiver Substanzen mit Crotonaldehyd-Diaminobenzophenon

SummaryA staining procedure is described for the specific fluorochromation of tissue structures which are aldehyde fuchsin-positive. The fluorochrome is formed by a reaction of crotonaldehyde with 4,4′-diamino-benzophenone.The tissue sections stained by this technique can be mounted and preserved in Eukitt without alteration of their fluorescence. Structures fluorochromized with “crotonaldehydediaminobenzophenone” have been investigated by means of microspectrofluorometry.ZusammenfassungEs wird ein Verfahren zur elektiven Fluorochromierung Aldehydfuchsin-positiver Gewebsstrukturen beschrieben. Bei dem verwendeten Fluorochrom handelt es sich um eine Verbindung, die aus Crotonaldehyd und 4,4′-Diamino-benzophenon entsteht.Die nach dieser Methode gefärbten Schnitte können ohne Beeinträchtigung ihrer Fluoreszenz in Eukitt eingeschlossen und aufbewahrt werden. Das fluoreszenzoptische Verhalten der mit „Crotonaldehyd-Diaminobenzophenon“ fluorochromierten Strukturen wird mikrospektrofluorometrisch untersucht.

Beiträge zur funktionellen Morphologie der Neurohypophyse

SummaryBilateral adrenalectomy and hypophysectomy in the rat produce similar histological changes in the outer layer of the median eminence. In both cases, abundant “gomoripositive” granules are observed in the outer layer, which normally reacts “gomorinegative”. The “gomoripositive” granules seem to belong to fibres running vertically through the infundibulum.These findings are regarded as a further indication, that the “gomoripositive” substances of the outer layer of the median eminence play a significant role in controlling adrenocortical function.ZusammenfassungBeidseitige Adrenalektomie und Hypophysektomie führen bei der Ratte zu gleichartigen histologischen Veränderungen in der Zona externa infundibuli. In beiden Fällen treten in der normalerweise weitgehend „goniorinegativen“ Zona externa infundibuli große Mengen „gomoripositiver“ Granula auf. Sie scheinen Fasern anzugehören, die senkrecht zur Längsachse des Infundibulum verlaufen.Die Befunde werden als weiterer Hinweis dafür betrachtet, daß die „gomoripositiven“ Substanzen der Zona externa infundibuli eine Bedeutung für die Steuerung der Nebennierenrindenfunktion haben.

Histochemical and immunohistochemical properties of the CRF-Granules and other „Gomori-positive” substances of the rat

SummaryIn adrenalectomized rats, histochemical and immunohistochemical properties of the following secretion products have been investigated:1.CRF-granules in the outer layer of the median eminence;2.neurosecretory material (NSM) in the supraoptico-hypophysial system of the hypothalamus;3.secretory granules in the TSH-cells of the anterior lobe of the hypophysis;4.secretory granules in the ependymal cells of the subcommissural organ (SCO);5.β-cell-granules in the islets of Langerhans in the pancreas. All these substances are characterized by their stainability with the so-called “Gomorimethod”.The experiments have included studies into:a)the extractability of the substances by various solvents;b)the digestability of the substances by pepsin or trypsin;c)their histochemically detectable content of disulfide groups, arginine and periodic acid-Schiff (PAS) reactive carbohydrates;d)their reaction with porcine-neurophysin-II-antibodies. All substances exhibited a positive reaction for disulfide groups. Based on their solutility properties, their resistance to pepsin or trypsin, their respective content of PAS-reactive carbohydrates and their failure to react with anti-neurophysin serum the “Gomori-positive” granules in TSH-, SCO- and pancreatic β-cells can be distinguished from one another and from CRF- and neurosecretory granules. In contrast, CRF-granules and NSM showed identical properties.Taking into consideration data from the biochemical and histochemical literature, the present findings suggest that CRF-granules and NSM consist of closely related biochemical substances.

Enzymhistochemische Untersuchungen an Infundibulum und Hypophysenhinterlappen der normalen und beidseitig adrenalektomierten Ratte

Das Verhalten verschiedener Enzyme (NADH-Cytochrom-c-Reduktase, Laktatdehydrogenase, Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, Monoaminoxydase, α-Naphthylacetatesterasen, 5-Bromindoxylacetatesterasen, Acetylcholinesterase, Lipasen, alkalische Phosphatasen und saure Phosphatasen) in Infundibulum und Hypophysenhinterlappen wurde an normalen und an beidseitig adrenalektomierten Ratten untersucht. Die Aminopeptidasen-Aktivitat der Zona externa infundibuli nimmt als Folge des Eingriffs zu, wahrend die Aktivitat der α-Naphthylacetatesterasen im Bereich der gesamten Neurohypophyse abnimmt. Die weitere Differenzierung der das α-Naphthylacetat spaltenden Fermente ergab, das es sich um Aliesterasen mit lipaseartigem Charakter handelt. Die moglichen Zusammenhange zwischen diesen Befunden und dem Verhalten der „Gomori-positiven“ Substanz der Zona externa infundibuli nach beidseitiger Adrenalektomie werden diskutiert.SummaryThe behavior of various enzymes in the infundibulum and neural lobe of the hypophysis of the normal and bilaterally adrenalectomized rat was investigated. As a result of the operation the activity of the aminopeptidases in the zona externa infundibuli increases, whereas the activity of the α-naphthylacetate-esterases in the whole neurohypophysis decreases. Further analysis of the α-naphthylacetate-splitting enzymes showed that these enzymes belong to the group of ali-esterases and have a lipase-like character. The possible connection between these findings and the changes in the “Gomori-positive” substance in the zona externa following bilateral adrenalectomy is discussed.ZusammenfassungDas Verhalten verschiedener Enzyme (NADH-Cytochrom-c-Reduktase, Laktatdehydrogenase, Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, Monoaminoxydase, α-Naphthylacetatesterasen, 5-Bromindoxylacetatesterasen, Acetylcholinesterase, Lipasen, alkalische Phosphatasen und saure Phosphatasen) in Infundibulum und Hypophysenhinterlappen wurde an normalen und an beidseitig adrenalektomierten Ratten untersucht. Die Aminopeptidasen-Aktivität der Zona externa infundibuli nimmt als Folge des Eingriffs zu, während die Aktivität der α-Naphthylacetatesterasen im Bereich der gesamten Neurohypophyse abnimmt. Die weitere Differenzierung der das α-Naphthylacetat spaltenden Fermente ergab, daß es sich um Aliesterasen mit lipaseartigem Charakter handelt. Die möglichen Zusammenhänge zwischen diesen Befunden und dem Verhalten der „Gomori-positiven“ Substanz der Zona externa infundibuli nach beidseitiger Adrenalektomie werden diskutiert.

Zur Spaltbarkeit verschiedener Naphthol-Carbonsäureester durch Esterasen im Tanycytenependym des III. Ventrikels der Wistarratte

SummaryIn the Wistar rat, the tanycytes of the IIIrd ventricle contain unspecific esterases which are E 600 sensitive and are not inhibited by p-chlormercuribenzoate. To further investigate the character of these enzymes, their ability to split various naphtholcarbonic acid esters in the presence of organic solvents was tested. It was hereby established that the esterases of the tanycytes behave differently to those of the diencephalic nerve cells. In the tanycytes among various homologous carbonic acid esters of α-naphthol applied, α-naphthyl butyrate shows the highest splitting ratio; with acetate esters of AS-naphtholes differing but always weaker reactions are obtained than with α-naphthyl-acetate. As in a former study, behavioral divergencies of esterase activity in the tanycyte perikaria and processes were observed. — On the basis of these findings the possibility is discussed that the esterases of the tanycytes might play a role in synaptic transmission.ZusammenfassungIm Tanycytenependym des III. Ventrikels kommen bei der Wistarratte unspezifische, E 600-empfindliche und gegenüber p-Chlormercuribenzoat resistente Esterasen vor. Um diese Enzyme histochemisch weiter zu charakterisieren, wurde ihre Fähigkeit geprüft, verschiedene Naphthol-Carbonsäureester bei Anwesenheit von Lösungsvermittlern zu spalten. Es zeigte sich hierbei ein unterschiedliches Verhalten der Esterasen in Ganglienzellen und Tanycyten. In letzteren weist von verschiedenen homologen Carbonsäureestern des α-Naphthols der Buttersäureester die höchste Spaltungsrate auf; Acetatester der Naphthol-AS-Reihe ergeben unterschiedliche, aber stets schwächere Reaktionen als α-Naphthylacetat. Wie in früheren Untersuchungen wurden Unterschiede im Verhalten der Esterasen-Aktivität in Perikaryen und Fortsätzen der Tanycyten beobachtet. — Auf Grund der Befunde wird die Möglichkeit einer Einschaltung der Tanycytenesterasen in die Erregungsübertragung diskutiert.

Distribution and properties of an adenosine triphosphatase in the tanycyte ependyma of the IIIrd ventricle of the rat

SummaryThe distribution, histochemical properties and ultrastructural localization of adenosine triphosphate (ATP) hydrolyzing enzymes in the tanycyte ependyma of the third ventricle have been studied in female Wistar rats.Using a calcium-cobalt procedure and a lead capture technique, splitting of ATP could be demonstrated in perikarya and processes of tanycytes in the region of the ventromedial nucleus. The reaction showed no dependence on magnesium or sodium ions, did not occur with other monodi-, and tri-phosphates as substrates, and was inhibited by p-chlormercuribenzoate (PCMB) and sodium fluoride, but not by ouabain. With the calciumcobalt method the highest intensity of reaction was found at pH 9.4, whereas the lead method gave optimal results at pH 6–8.At the ultrastructural level, the reaction product was found at the outer surface of the plasma membranes of tanycytes and reached its highest concentrations in the region of the apical microvilli.From the findings it is concluded that splitting of ATP in tanycytes is due to a true ATPase. The enzyme might be involved in an active transport of substances by tanycytes.