Shichiro Sugawara

Development of bovine oocytes matured, fertilized and cultured in a serum-free chemically defined medium

Abstract This experiment was conducted to determine if bovine embryos derived from in vitro maturation, fertilization and culture could develop in serum-free medium. Oocytes were matured and cultured in TCM199 supplemented with or without fetal calf serum (FCS), and in TCM199 supplemented with growth factors (GF-TCM199), namely epidermal growth factor, insulin and transferrin. The proliferation of cumulus cells co-cultured with embryos was also examined. The highest rate of embryo cleavage (48%; 2-cell/total) and blastocyst formation (30%; blastocyst/2-cell) was obtained in serum-supplemented medium, and the extensive cumulus cells proliferation formed a monolayer within 3 d of culture. In TCM199 alone, no cleaved embryos developed to the blastocyst stage, and very limited cell proliferation was observed. In GF-TCM199, 3% of cleaved embryos developed to the blastocyst stage. The collagen-coated dish improved cumulus cell growth, and the rate of blastocyst formation was 8%. The viability of these embryos was judged by transfer, with one of the three recipients becoming pregnant and delivering one calf. In conclusion, the results indicated that collagen-coating and growth factors-supplementation can support embryonic development in serum-free TCM199; however, development in vitro was significantly less extensiver than that in serum-supplemented TCM199.

Intra uterine survival and growth of Wistar and Wistar × Brown Norway rat embryos

Embryos of the Wistar strain and its F(1) cross (Wistar females mated with Brown Norway males) of rats were transferred nonsurgically to 48 Wistar, 17 F(1) cross and 20 Wistar-Imamichi recipients. The two types of embryos were transferred together to each recipient to compare the viability of the embryos. Pregnancy rate was 78.8% (67 85 ). The survival rate of fetuses to term was 11.5% (20 174 ) and 25.1% (42 168 ) for the Wistar and F(1) embryos, respectively. Placental weight differed significantly (P<0.05) between embryo types and among recipient types while fetus weight differed (P<0.01) only among recipient types, with a significant interaction between recipient and embryo types (P<0.01). It was concluded that the F(1) embryos (Wistar x Brown Norway) were twice as viable as Wistar embryos under the conditions provided.

Scanning eletron microscopical observations on the rat sperm head trapped by ovum microvilli during the penetration into ovum in vivo.

ラット受精過程のうち,精子頭部が卵細胞に接触後,卵細胞質突起で覆われるまでの過程を走査型電顕で観察した。精子頭部は卵細胞に接触後,線維状に伸びた卵子微絨毛によって巻き込まれていた。微絨毛は規則正しく糸巻き状を示し,特に赤道域中央付近で多く認められた。その後,微絨毛によって捕獲された精子頭部は卵細胞質突起によって覆われる。

Prolongation of diestrus after removal of pups in lactating rats.

The recurrence of diestrus following removal of pups on day 10 of lactation was studied in lactating rats. Pituitary responsiveness to LHRH, and plasma LH, prolactin and progesterone levels were determined after removal of pups. Diestrous periods following romoval of pups were 8.61±0.36 and 3.33±0.21 days in the females which had been nursing 12 and 2 pups, respectively. Seventy-eight % of animals that had nursed 12 pups exhibited typical vaginal smear of pro-estrus on day 2 or 3 of post-weaning, but none of these animals ovulated on the following day. The number of follicles over 550μm in diameter rapidly in-creased from day 1 (1.7±1.2) to day 2 of post-weaning (7.6±1.9) in females that had nursed 12 pups. On day 2 or 3 of post-weaning obvious LH surge occurred in females that had nursed 2 pups, but not in animals that had nursed 12 pups. The rise of plasma LH levels following LHRH injection was less and the ovulatory responsiveness to LHRH injection was lower in females nursing 12 pups than those in rats nursing 2 pups on day 2 or 3 of post-weaning. High plasma progesterone levels were maintained until day 6 of post-weaning in animals that had nursed 12 pups, while concentration decreased to the basal level within 18 h after removal of pups in females nursing 2 pups. In accordance with the high level of plasma progesterone, the fluctuation of prolactin levels was observed following removal of pups in animals that had nursed 12 pups. It was suggested that the prolongation of the diestrous period following removal of pups in the rats nursing a large litter was attributable to the reduced responsiveness of pituitary to LHRH and to the maintenance of functional corpora lutea formed at post-partum ovulation.

Isolation of rat immunoglobulins and determination of immunogiobulins in rat uterine fluid.

本報では,ラットのimmunoglobulinの分離同定およびその物理化学的性質をしらべると共に,子宮液中のimmunoglobulinの存在様式の特異性について検討した。IgGとIgAは血清および初乳乳清から,塩析,gel ?? 過およびイオン交換column chromatographyによって分離された。それらの物理化学的性質の検討をdiscおよびSDS gel電気泳動,免疫電気泳動および蔗糖密度勾配遠心分離により行ったところ,IgGとIgAの分子量,それらのsubclassと免疫化学的性質が明らかにされた。子宮液中のimmunoglobulinについて,免疫化学的方法により同定したところ,IgGが著しく少なく,IgAと免疫化学的に共通であり,IgAより分子量の小さいimmunoglobulinが認められた。

Studies on protein components in uterine fluid and their origins in early pregnant rats.

妊娠3日目から7日目までのラット子宮液の蛋白質成分とその由来について検討した。1.子宮液の蛋白質量は,妊娠の経過に伴い漸増しており,6日目以降では急激に増加した。2.妊娠初期における子宮液の蛋白質の増加は,実験的処理による観察の結果,エストロジェンの分泌および卵子の着床刺激による脱落膜の形成の結果であることが示唆された。3.子宮液の蛋白質成分は,ディスク電気泳動および免疫化学的分析の結果から,量的な差異が見られたが,血清のそれに類似していることが示された。4.FITC標識の血清蛋白質により,血中から子宮腔への血清蛋白質の移行を検討した。その結果,血清蛋白質が妊娠初期の子宮液の蛋白質の経時的な増加に大きく関与しており,これらの変化は卵巣ホルモンに支配されていることが明らかにされた。

Effects of Estrone on Incorporation of 14C-Glutamic Acid inRat Blastocyst during Delayed Implantation

着床遅延時においてエストロンの単一投与がグルタミン酸の取込みに及ぼす影響について検討した.スメア像に精子を見つけた日を妊娠第1日とし,妊娠3日目に去勢し,その後1日当りプロジェステロン4mg/0.2mlを連続注射した.受精後102時間目(妊娠5日目),172時間目(妊娠8日目)にそれぞれエストロン4μg/0.2mlを単一投与し,投与後6,12,18,24,30時間目のそれぞれの卵子をもちいて,グルタミン酸の取込みを調べた.なおコントロールとして正常妊娠5～6日目の卵子およびプロジェステロンのみを注射した場合の同時間に相当する卵子を用いた.測定の方法等は,前報と同様でグルタミン酸の濃度0.5μc/ml(s.a.0.11)として,グルコースまたは乳酸を添加し37.5°C下で,0,60分間培養し,液体シンチレーションで測定した.着床遅延時の卵子はエストロン投与によりグルタミン酸の取込みが,あきらかに増加することが認められた.またエストロン投与後24,30時間目の卵子の取込みは,正常妊娠132時間日の卵子より低いが,それに近い取込みがみられた.前報で報告したように,グルコース,乳酸の添加により卵子のグルタミン酸の取込みを高め両者間に差が認められたが,着床遅延時の卵子においてはグルコース添加と乳酸添加との間に差はあまりみられなかった.

Free amino acids in blastocoelic fluid, uterine fluid and blood serum of the rabbit

ウサギについて,妊娠6日令から着床後の8日令の胚盤胞腔液の遊離アミノ酸組成を子宮分泌液,腹水,母体,血清などの組成と対比し分析した.また,それらの組成と卵巣摘出の影響についても検討した.6～8日令の胚盤胞腔液に18種類の遊離アミノ酸が同定された.この組成は子宮分泌液とほとんど同じであった.同定されたアミノ酸のうち,グリシン,アラニン,セリン,トレオニン,グルタミン酸,バリンが主なものであり,全体の約90～95%を占めた.これらアミノ酸のうち,とくに,グリシン,アラニンが最も多く約72～80%であった.また,胚盤胞腔液のこれらアミノ酸濃度は着床前が最も高く,子宮分泌液,血清と比較して著しく高いが,着床の開始と同時に減少し,血清濃度に近づいた,卵巣摘出により,グリシン,セリン,グルタミン酸が特異的に減少した.

Free amino acids in the uterine fluid of rats

ラットの種々のホルモン状態下における子宮分泌液中の遊離アミノ酸を定量した。16種のアミノ酸が,すべての状態下で同定された。またラットの子宮液中の遊離アミノ酸は,家兎と異なってグルタミソ酸が多く存在することを認めた。また着床前後に子宮液中の遊離アミノ酸が高まることを認めた。子宮分泌液の遊離アミノ酸と血清の遊離アミノ酸の間には,一定の関係はみられなかった。

Sex chromatin in rabbit embryos

受精卵の性鑑別を容易にするために,家兎受精卵におけるsex chromatinの出現日令と,存在部位の偏りを調べた。1~4日令の受精卵では,静止核がとらえにくく,sex chromatinが見られなかった。5日令では全体の35.4%の核に,6日令では全体の51.2%の核にsex chromatinがみられた。また,5日令と6日令の受精卵については,卵を4区にわけ,sex chromatinを有する核の割合をみた。5日令ではA区(内細胞塊)とD区(内細胞塊に対する側)との間に有意差がみられた。受精卵の性鑑別には,5日令と6日令のものがよく,5日令では,内細胞塊に対する側の細胞がよい。