Vladimir Sevcik

Laboratory fermentation of gibberellic acid

SummaryIn studying the fermentation conditions suitable for gibberellic acid production, 6 collection strains ofFusarium moniliforme andGibberella fujikuroi were used. The strain used was of decisive importance for the yield and composition of the effective metabolite.After verification of methods described in the literature a new medium for gibberellic acid production was developed to be used for fermentation on a shaker and in laboratory fermentors, the medium containing sucrose and corn steep liquor. By using a reciprocal shaker, maximum production of gibberellic acid was obtained after 14 days, by using three-stage propagations after 12 days of fermentation.Maximum values achieved during fermentation of the most suitable strains amounted to 150–240 μg./ml. Maximum production in laboratory fermentors reached 212 μg./ml.The metabolite isolated after fermentation under the described conditions was identified as gibberellic acid.AbstractПри изучении условий ферментации пригодные для gibberellic кислоты 6 коллекция штаммов Fusarium moniliforme и Gibberella fujikuroi были использованы Используется штамм имеет решающее значение за урожайностью и состав эффективный метаболит. После проверки методов, описанных в литературе нового средства массовой информации для gibberellic кислоты был разработан, которые будут использоваться для брожения на шейкер и в лабораторных fermentors, средних содержащие сахарозы и кукуруза крутых спиртными напитками. С помощью взаимных шейкер, максимум производство gibberellic кислота была получена после 14 дней, используя три этапа propagations по истечении 12 дней после брожения Максимальные значения, достигнутые в ходе ферментации из наиболее подходящие штаммы составил 150-240 μ g. / мл. Максимум производства в лаборатории fermentors достигло 212 μ g. / мл Метаболит изолированных после брожения в рамках описанных условиях определены в качестве gibberellic кислота

Factors affecting the production of various gibberellins during submerged cultivation ofGibberella fujikuroi

SummarySeparation of gibberellic acid from gibberellin A by paper chromatography directly in the fermentation media and characterization of the isolated crystalline products was used here to study the effect of cultivation conditions on the formation of these gibberellins during submerged cultivation ofGibberella fujikuroi.The production strain used is able produce both gibberellic acid alone and its mixture with gïbberellin A, in both cases at a rather high yield if suitable conditions are applied. Of the factors determining the quality of the active metabolite formed, the composition of the fermentation medium and particularly the quality of the nitrogenous source appear to be of the greatest, importance. However, some other factors, such as the initial pH of the culture or intensity of aeration were also found to play a role.The effect of corn steep liquor when used as the source of nitrogen in the fermentation medium is very pronounced with respect to the formation of gibberellic acid alone. In suspension media containing soybean or peanut meal a mixture of gibberellic acid with gibberellin A is formed under conditions suitable for maximum production of gibberellins.AbstractВлияние условий культивирования на образование гиббереллинов при глубиннои ферментации Gibberella fujikuroi изучали с помощью хроматографии на бумаге гибберелловой кислоты и гиббе-реллина А прямо в ферментационной среде и путем определения характера выделенных кристаллических продуктов.При благоприятных условиях применявшийся нами продуктивный щтамм способен образовать и одну только гиббелловую кислоту, и ее смесь с гиббереллином А и В обоих случаях дает сравнительно высокий выход. Из факторов, определяющих качество возникаюшего активного метаболита, наиболее выразительное влияние оказывает состав ферментационной среды, в особенности качество источника азота. Наблюдалося однако и влияние некоторых других факторов, напр., исходного pH культуры и интенсивности аэрации.Кукурузный экстракт как источник азота в ферментационной среде окзывает выразительное влияние на образование гибберелловой кислоты. В средах с суспензией соевой или арашидовой муки, в условиях, благоприьтных для получения максимальной общей продук-ции гиббереллинов, наблюдается образование смеси гибберелловой кислоты и гиббереллина А.

Isolation of gibberellic acid on ion-exchange resins

SummaryThe possibility of isolation of gibberellic acid by means of ion exchange resins was ascertained. The strongly basic anion exchange resins, Amberlite IRA-400, Fluka, Zerolit FF, in the hydroxyl form (prepared with HCOONa) were found to be most suitable for this purpose. After a complete saturation of the column (80–100 mg. gibberellic acid per 1 g. dry weight of the resin) the effective substance was eluted with 1N-HCOOH and the eluate extracted with the same amount of ethyl acetate. The ethyl acetate extract then yielded a crystalline preparation of gibberellic acid (40–55% as referred to the amount of substance placed on the column).AbstractБыли проверены возможности выделения гибберелловой кислоты с помощью ионообменников. Удобными оказались сильные шелочные ионообменники (Amberlite IRA-400, Fluka, Zerolit FF) в цикле OH′ (обработка HCOONa). После полного насьпцения колонки (на 1 г сухого веса обменника 80–100 мг гибберелловой кислоты) активное вешество злюировали 1N-HCOOH и злюат зкстрагировали таким зе обьемом этилацетата. Из этилацетатного экстракта получали кристаллический препарат гибберелловой кислоты при выходе 40–55% от количества вещества, помещаемого в колонку.

Submerged cultivation of the basidiomyceteBoletus edulis var.reticulatus

SummarySome problems of the submerged growth and development of a culture ofBoletus edulis var.reticulatus were investigated during laboratory fermentor cultivation. The mycelium was found to contain 18 amino acids with a predominance of α-alanine, glycine and lysine. The qualitative participation of amino acids was more striking than that of zymocasein. The crude protein of the fungus amounted to 57.5% mycelium dry weight while the efficiency of its formation from a given amount of sugar was 26%. The content of chitin in which no galactosamine was found increased with age of the culture but represented at most 0.48% mycelium dry weight.Abstractлееледвались некоторые вопросы глубинного роста и раэвития культуры Воletus edulis var. Reticulates B лабораторном ϕерменторе. В мицелии было установлено 18 аминокислот с преобладанием α-аланина, глицина и лизина. Представлсны был аминокислоты, в качественном отншении более выразительные, чем аминокисоты в эимокаэеине. Общсе количество беков грибка составляло до 57,5% сухого вещества мицелия, причем эϕϕективностъ их обраэования иэ опредеднного количества сахара состаляла 26%. Содежание в мицелии хитина, в котором не был найден галактозамин, с возрастом культуры увелядо максимально лишь 0,48% сухого вещества мицелия.

Použití papírové chromatografie při výzkumu nových antibiotik

РезюмеИсида оригинальные кратко chromatogram была скорре ктирована такимобра зом, что результаты могут быть используе тся не только для дет ального выявления неизвестныхантибио тикам, но и в подготов ке сырой антибиотика путем экстракции из ферментации жидкос ти ивозможно в ее дал ьнейшей очистки. В восходящей хромат ографии следующих систем растворител ей былииспользованы: 1. дистиллированной воды, 2. решение в NH4C1 (3%), 3. метиловый спирт (100%), 4. ацетон (100%), 5. этилацета т пропитанный водой, 6. н-бутиловый спирт-во да насыщается, 7. этило вый эфир насыщен вод ой, 8. хлороформ, 9. бензол, 10. нефтяного эфира. Раз мер пятна по антибио тикам chromatogram напрямую зав исит время диффузии из блок на бумаги. Под вижность антибиоти ков является под влиянием отдель ных питательных сре дств массовой инфор мации, однако их влия ние не является дост аточно большим, прив едет к выводы по раст воримость антибиот иков в растворителях, используемых. В ходе разработки путем орошения н-бут илового спирта и эфи ра, Создание двух точ ек был замечен в случае Дактиномицин, эритромицин и хлорам феникола. Кратко были проведены с стрептом ицин (рис. 4), Дактиномиц ин (рис. 5), хлорамфенико ла (рис. 6) хлорамфенико ла BU 607 (рис. 7). Результаты соответствуют метод ы изоляции, используе мые для антибиотиков в вопрос.SummaryIshida’s original summarised chromatogram was adapted in such a manner that the results could be used not only for detailed identification of an unknown antibiotic but also in the preparation of the crude antibiotic by extraction from the fermentation fluid and possibly in its further purification. In ascending chromatography the following systems of solvents were used: 1. distilled water, 2. solution of NH4C1 (3%), 3. methyl alcohol (100%), 4. acetone (100%), 5. ethyl acetate saturated with water, 6. n-butyl-alcohol saturated with water, 7. ethyl ether saturated with water, 8. chloroform, 9. benzene, 10. petroleum ether. The size of the spots of the antibiotic on the chromatogram depends directly on the time of diffusion from the agar block on to the Chromatographie paper. The motility of antibiotics is influenced by the individual nutrient media, but their influence is not great enough to lead to wrong conclusions on the solubility of the antibiotics in the solvents used. During development of the chromatograms by means of waterless n-butyl alcohol and ether, the formation of two spots was observed in the case of actinomycin, erythromycin and chloramphenicol. Summarised chromatograms were carried out with streptomycin (fig. 4), actinomycin (fig. 5), chloramphenicol (fig. 6) and antibiotic BU 607 (fig. 7). The results correspond to the methods of isolation used for the antibiotics in question.

Лабораторная фермен тация актиномицина Б актиномицетом Streptomyces antibioticus

SouhrnZískané výsledky při stanovení optimálních podmínek pro produkci a účinnost lakkásy aktinomyoetyStreptomyces antibioticus byly aplikovány při fermentaci aktinomycinu tím způsobem, ze byla vyvinuta pro submersní fermentaci na třepacím stroji půda se sekundárním fosforečnanem amonným. Vyšší produkce aktinomycinu B na půdách s fosforečnany je způsobena pouze nizším pH prostředí a ne přítomností fosforečnanu jako specifického substrátu. Význam fosforečnanu spočí vá v torn, ze udrzuje v prvých fázích vývoje kultury pH na hodnotě okolo 5. Za těchto podmínek byly získány velmi vysoké produkce aktinomycinu, který vypadává jiz během kultivace z přesyceného roztoku v kultivační tekutině.Maximální produkce aktinomycinu B u aktinomycetyStr. antibioticus byla v době počínající autolysy mycelia (klesající sušina, zvyšující se rozpustný dusík, prakticky zádné cukry v kultuře).Jelikoz nejvyšší produkce aktinomycinu byla na půdě s 0,35 % kukuřičného extraktu az po spotřebování všech cukrů, byla vypracována zivná půda s vyšš í koncentrací cukrů (1 % glukosy a 2 % laktosy), na níz byla získána produkce aktinomycinu okolo 500 μg/ml.РезюмеРезультаты, полученн ые нами при определен ии оптимальных условий для продукции и эффективности лакк азы актиномицета Streptomyces antibioticus, были использованы при ферментации актином ицина: для глубинной ф ерментации на качалке была приго товлена среда с (NH4)2HPO4, в которой в первых фазах развити я культуры рН остается на уровне около 5,0. Повышение прод укции актиномицина Б в средах с фосфатами обусловле но только более низким рН среды, а не присутствием фос фатов как специфического субс трата. При этих условиях получалась очень высокая продук ция актиномицина, которы й уже в течение культи вации выпадает из перенасы щенного раствора культивационной сре ды. Максимальная прод укция актиномицина Б у акти номицета Streptomyces anfcibioticus наблюда лась в период начала автолиза мице ллия. Так как в среде с 0,35% кукурузного экстрак та максимальная продукция актиномиц ина получалась уже по сле истощения всех Сахар ов, была предложена питательная среда с б олее высоким содержа нием Сахаров (1% глюкозы и 2% ла ктозы), в которой достигалас ь продукция актиноми цина около 500 μг/мл.SummaryThe results obtained when determining optimal conditions for the production and effectiveness of the laccase ofStreptomycea antibioticus were applied in the fermentation of actinomycin by evolving a medium for submerged fermentation on a shaker apparatus; the medium contained (NH4)2HPO4, which the maintains pH at about 5.0 during the first hours of development of the culture. The higher production of actinomycin B on media containing phosphates is due only to the low pH of the medium, and not specifically to the presence of the phosphate. These conditions gave a very high yield of actinomycin, which was already precipitated out of the oversaturated solution in the culture fluid during culture. Production of actinomycin B byStreptomyces antibioticus was highest during the period commencing with autolysis of the mycelium. Since on a medium containing 0,35% corn steep, production of actinomycin did not reach its highest point until all the sugars had been assimilated, a medium containing a higher concentration of sugars was elaborated (1% glucose and 2% lactose), on which the production of actinomycin was about 500 μg./ml.

Продукция актиномиц ина Б у нового штамма Streptomyces antibioticus

SouhrnZ nově isolovaného kmene aktinomycety isolované z půdního vzorku a identifikované jakoStreptomyces antibioticus byl získán krystalický preparát antibiotika, který byl identinkován jako aktinomycin B.Aktinomycin B byl rozdělen chromatograficky na sloupci Al2O3 na dvě účinné frakce.Antibiotikum působí převázně na grampositivní bakterie a slabě na houby. Na Ehrlichův ascitický tumor působí u kontaktního testu v koncentraci 0,5 az 2 μg/myš.РезюмеИз нового штамма акти номицета, изолирован ного из образца почвы и идент ифицированного как Streptomyces antibioticus, был получен кр исталлический препа рат антибиотика, который был идентифи цирован как актиноми цин Б. Хроматографически а ктиномицин Б был в столбце аl2о3 разделе н на две эффективные ф ракции. Антибиотик действуе т преимущественно на грам-положительны е бактерии и слабо—на грибки. На асцитическую опухол ь Эрлиха антибиотик де йствует в контактном тесте при концентрации 0,5–2,0 μг/мы шь.SummaryA crystalline antibiotic preparation, identified as actinomycin B, was obtained from a new strain of actinomycete isolated from a soil sample and identified as Streptomyces antibioticus. The actinomyoin B was separated chromatographically on an Al2O3 column into two effective fractions. The antibiotic is active chiefly against Gram-positive bacteria and shows weak activity against fungi. In a contact test it acted against Ehrlich’s ascitic tumour in a concentration of 0.4–2.0 μg./mouse.

Отношение биосинтез а эритромицина к неко торым процессам превращен ия пировиноградной кис лоты у штамма Streptomyces erythreus

SouhrnPřídavek arsenitanu sodného v konečné koncentraci 4 . 10-4 M do fermentační půdy produkčního kmeneStr. erythreus na poěátku kultivace snizuje biosynthesu erythromycinu v maximu o 87% při současném zvýšeném hromadění kyseliny pyrohroznové. Přídavek octanu sodného nebo propionanu sodného v konečné koncentraci 0,5 % výrazně snizuje inhibiční vliv arsenitanu na biosynthesu erythromycinu. Naproti tomu pyrohroznan, jantaran, jablečnan, citran, mléčnan, glycin a acetylglycin úěinek arsenitanu neruší.Arsenitan zcela inhibuje oxydativni dekarboxylaci pyrohroznanu a oxydaci octanu promytým myceliem aktinomycetyStr. erythreus, zatím co oxydaci glukosy inhibuje jen částečně.Za normálních podmínek je biosynthesa erythromycinu podmíněna nerušeným průběhem oxydativní dekarboxylace kyseliny pyrohroznové na kyselinu octovou.Na základě uvedených výsledků byla diskutována pravděpodobná účast kyseliny octové jako výchozího substrátu pro biosynthesu kyseliny propionové, která je předpoklá daným prekursorem laktonového jádra molekuly erythromycinu.РезюмеПрибавление мышьяко вистокислого натрия в окончательной конце нтрации 4 . 10−4 М к ферментационной ср еде производственно го штамма S. erythreus в начале культиваци и понижает биосинтез эритромиц ина в максимуме на 87 % пр и одноврменном повыше нии накопления пировиноградной кис лоты. Прибавление укс уснокислого натрия или пропионат а натрия в окончательной конц ентрации 0,5% выразитель но понижает угнетающее влияние мышьяковист окислого натрия на биосинтез э ритромицина. — Соли же пировиноградной, янт арной, яблочной, лимонной и м олочной кислот, глици н и ацетилглицин не нару шают действия мышьяковистокислог о натрия. Мышьяковист окислый натрий полностью под авляет окислительно е декарбоксилировани е соли пировиноградн ой кислоты и окисление соли уксус ной кислоты промытым миц еллием актиномицета S. erythreus, тогда как окисление глюкоз ы он подавляет лишь отч асти. При нормальных у словиях биосинтез эритромиц ина обусловлен бесперебойным ходом окислительного декарбоксилировани я пировиноградной ки слоты в уксусную кислоту. — Н а основе вышеизложен ных данных обсуждается вероятн ость участия уксусной кислоты как исходного субстрата для биосинтеза пропионо вой кислоты, являющей ся предполагаемым пред шественником лактон ового ядра молекулы эритромици на.SummaryThe addition of sodium arsenite in a final concentration of 4 . 10-4 M to the fermentation medium of a producing strain ofS. erythreus at the beginning of cultivation reduced biosynthesis of erythromycin by 87%, with a simultaneous increase in the accumulation of pyruvic acid. The addition of sodium acetate or sodium propionate in a final concentration of 0.5% markedly decreased the inhibitory effect of arsenite on erythromycin biosynthesis. Pyruvate, succinate, malate, citrate, lactate, glycine and acetyl glycine did not reduce the effect of arsenite. Arsenite completely inhibited oxidative decarboxylation of pyruvate and oxidation of acetate by the washed mycelium of S. erythreus, but only partly inhibited glucose oxidation. Under normal conditions, biosynthesis of erythromycin depends on uninterrupted oxidative decarboxylation of pyruvic acid to acetic acid. On the basis of the above results, the authors discuss the probability of the participation of acetic acid as the initial substrate in the biosynthesis of propionic acid, which is assumed to be the precursor of the lactone nucleus of the erythromycin molecule.

Orientační stanovení iontového charakteru antibiotik plotnovými testy

РезюмеТест был разработан для определения ионных характер неизвестных антибиотиков путем agar пластинами. Агар блоков со зрелыми actinomycetes помещаются в основной agar среды, над которыми agar средние содержащие катионообменной смолы или ROA Fluka СПЛ анион обмен смола заливается Агар средний привитых с микроорганизмов затем вылил на agar средних содержащие ионообменные смолы Результаты. оцениваются путем сопоставления Средние ингибирования зон полученные после 18 часов инкубации при 37 ° в средние содержащие ионообменные смолы и средних ингибирования зон в контроле части знака не содержащих ионов обмен смолы Хотя этот метод. является менее точное чем документ электрофорез, она является удовлетворительной для использования в первой выборочной тесты из-за его простоты и быстрота.SummaryA test was elaborated for determining the ionic character of unknown antibiotics by means of agar plates. Agar blocks with mature actinomycetes are placed in the basic agar medium, over which an agar medium containing cation exchange resin ROA or Fluka STG anion exchange resin is poured. Agar medium inoculated with a micro-organism is then poured over the agar medium containing ion exchange resin. The results are evaluated by comparing the averages of inhibition zones obtained after 18 hours’ incubation at 37° in the medium containing ion exchange resin and the averages of inhibition zones in the control part of the plate containing no ion exchange resin. Although this method is less exact than paper electrophoresis, it is satisfactory for use in the first selective tests because of its simplicity and quickness.

Pronikání antibiotik dialysační membránou na agarových plotnách

РезюмеСпособность антибиотиков неизвестных нитью мембраны для диализа определяется по agar плиты путем размещения площадью мембраны на табличке agar привитых с тест микроорганизмов и покрытия с agar блок с полной возросла культура actinomycete Привитых agar табличку. на которой agar блок со зрелой культуре actinomycete помещается без вмешательства мембранные выполняет функции, контроля После чего в течение шести часов в лаборатории температура agar блоки-и ультрафильтров удаляются а таблички инкубировали в термостате в течение 18 часов при температуре 28 ° C. пропитывание антибиотика через мембрану является свидетельством путем ингибирования зону по agar пластине.SummaryThe ability of unknown antibiotics to permeate a membrane for dialysis is determined on agar plates by placing a square of membrane on an agar plate inoculated with the test micro-organism and covering it with an agar block with a fully grown culture of the actinomycete. An inoculated agar plate on which an agar block with a mature culture of the actinomycete is placed, without an intervening membrane, serves as the control. After leaving for six hours at laboratory temperature, the agar blocks-and ultrafilters are removed and the plates are incubated in a thermostat for 18 hours at 28° C. Permeation of the antibiotic through the membrane is evidenced by an inhibition zone on the agar plate.