W. Oehlert

Autoradiographic studies of the initial cellular response to injury

Abstract The autoradiographic method was employed to study the mechanism of the response to injury of the epithelium and connective tissue in the skin and tongue of the rat. Skin and tongue were studied at various times after an incision had been made in them, and after superficial cauterization of the tongue. 1. 1. The tongue showed a rapid increase in the number of labeled cells 200–300 basal cells distant from the wound edge. Very few cells were labeled immediately adjacent to the defect until 72 hr after injury, when the maximum 3 H-index was within 100 cells of the wound edge. The skin exhibited a rise in the number of labeled cells by a factor of five, 1 hr after injury, at a distance of approximately 500 basal cells from the edge of the defect. Similar results were found at 24 and 48 hr after incision. At 96 hr after injury, the maximum 3 H-index was within 100 cells of the wound. 2. 2. Cauterization with silver nitrate destroyed only the upper few layers of epithelium, and produced no sub-epithelial inflammatory response. The number of labeled cells increased to a maximum at 24 hr only in those regions lying below the cauterization. At 48 hr the 3 H-index had returned to normal. 3. 3. The connective response was slower than the epithelial response in both skin and tongue. The first rise in connective tissue labeling appeared 12 hr after injury in the skin, and after 48 hr in the tongue. 4. 4. It is suggested that the results of the studies on epithelium are consistent with the postulated presence of an inhibitor substance produced by differentiated cells in the upper layers of the epithelium. The slower response of the connective tissue in the tongue may be due to a difference in inflammatory processes.

Die Vorstufen des 1,2-Dimethylhydrazin-induzierten Dick- und Dünndarmcarcinoms der Ratte

Weekly s. c. injections of 21 mg 1,2-dimethylhydrazine/kg body weight induced in rats papillomas and carcinomas of the small and large intestine. In 12 of a total of 77 rats adenocarcinomas arose in the large intestine between the 10th and 16 th week after starting the injections. In the same groups 3 carcinomas and 21 papillomas of the small intestine were detected histologically. Autoradiographic investigations after application of 34S-sulphate and 3H-thymidine showed between the 5th and 12 th weeks alterations of the mucosa of the large intestine characterized by a decrease in the number of mucous secreting cells. The differentiation of basal epithelial cells to mucous secreting cells was inhibited. In the same regions the number of DNA synthesizing cells increased, producing an enlargement of the proliferation zone which reached from the bottom of the crypts up to the surface of the mucosa. The labelling index increased 3 fold compared to the normal. Also in the small intestine the “indifferenzzone”, being normally identical with the crypts of Lieberkühn, extended the length of the villi. The epithelial cells of the tips of the villi showed a high proliferating activity. Papillomas developed in those areas closely related to the proliferation activity of the epithelia. As in the large intestine the areas with enlarged proliferation zones showed a loss of cellular differentiation. Den nach wöchentlicher Applikation von 1,2-Diemthylhydrazin im Dünn- und Dickdarm der Ratte sich entwickelnden Carcinomen sind Veränderungen an der Schleimhaut vorgeschaltet, die durch eine Entdifferenzierung und Proliferationssteigerung charakterisiert sind. Im Autoradiogramm finden sich dabei nach Applikation von 3-H-Thymidin in der Dickdarmschleimhaut Herde, in denen bei völligem Fehlen der Becherzellen die Proliferationszone bis an die Schleimhautoberfläche heranreicht. Im Dünndarm verbreitert sich die Indifferenzzone über die gesamte Zotte hinweg. Vor allem die Veränderungen am Dickdarm sind in jeder Beziehung denen ähnlich, die man bei der Schleimhautregeneration beobachtet.Den nach wochentlicher Applikation von 1,2-Diemthylhydrazin im Dunn- und Dickdarm der Ratte sich entwickelnden Carcinomen sind Veranderungen an der Schleimhaut vorgeschaltet, die durch eine Entdifferenzierung und Proliferationssteigerung charakterisiert sind. Im Autoradiogramm finden sich dabei nach Applikation von 3-H-Thymidin in der Dickdarmschleimhaut Herde, in denen bei volligem Fehlen der Becherzellen die Proliferationszone bis an die Schleimhautoberflache heranreicht. Im Dunndarm verbreitert sich die Indifferenzzone uber die gesamte Zotte hinweg. Vor allem die Veranderungen am Dickdarm sind in jeder Beziehung denen ahnlich, die man bei der Schleimhautregeneration beobachtet.

Untersuchungen über die Generationszeit, DNS-Synthesezeit und Mitosedauer von Zellen der hyperplastischen Epidermis und des Plattenepithelcarcinoms der Maus nach Methylcholanthrenpinselung

Mit einer 0,25%igen Lösung von Methylcholanthren in Benzol wurden weiße Mäuse einmal wöchentlich über längere Zeit gepinselt. Im Stadium der Hyperplasie, der Papillome und der Carcinome wurden Gewebsproben für die autoradiographische Untersuchung nach einmaliger Injektion von 3H-Thymidin entnommen. In der hyperplastischen Epidermis und im Papillom besteht keine verlängerte Lebensdauer der postmitotischen Zellen gegenüber der normaler mehrschichtiger Epithelien. Dagegen kommt es bei der Cancerisierung der Epidermis über das Stadium der Hyperplasie bis zum Carcinom zu einer kontinuierlichen Vrekürzung der Generationszeit als Ausdruck der verstärkten Zellproliferation. Sie beträgt in der normalen Epidermis rund 150 Std, in der hyperplastischen 56 Std und im Plattenepithelcarcinom der Haut 32 Std. In analoger Weise erhöht sich die Mitoserate. Die DNS-Synthesephase bleibt mit 8 Std annähernd unverändert, während die prämitotische Ruhephase bis zum Carcinom hin eine zunehmende Schwankung aufweist, die jedoch nicht über die Länge der DNS-Synthesephase hinausgeht. Mithin besteht bei der Umwandlung der normalen Epidermiszelle in eine Krebszelle die Hauptveränderung des Wachstums in einer Verkürzung der Differenzierungsphase der sich teilenden Zellen. The skin of albino mice was painted weekly with a 0.25% solution of methylcholanthrene in benzol over a prolonged period. After a single injection of H3-thymidine biopsies were taken of the hyperplasia, the papillomata, and the carcinomas for radioautographic studies. In the hyperplastic epidermis and in the papillomata the postmitotic cells did not persist for prolonged periods as did those of normal multilayered epithelia. On the contrary, with the cancerization of the epidermis through the stage of hyperplasia to carcinoma there was a continuous reduction in the generation time, indicating an increased proliferation of cells. In the normal epidermis this time was about 150 hours, in the hyperplastic 56 hours, and in the cutaneous squamous cell carcinoma 32 hours. In an analogous manner the mitotic rate increased. The phase of DNA synthesis remained approximately unchanged at 8 hours, whereas the premitotic resting phase up to the carcinoma showed an increasing fluctuation which, however, did not exceed the length of the phase of DNA synthesis. Thus, with the change of the normal epidermal cell into a cancer cell the main change of growth consists of a shorting of the differentiation phase of the dividing cells.

Lichtmikroskopische und autoradiographische Befunde bei der Cancerisierung der Rattenleber mit Methyl-Allyl-Nitrosamin

Weekly intravenous injections of 20 mg Methyl-allyl-nitrosamine per Kg body weight led to hepatic cirrhosis in all the experimental animals, and after nine months to haemangio-endotheliomata and hepatomata. The mesenchymal proliferation in hepatic cirrhosis was centrilobular in origin and depended on the activation of fibroblasts and v. Kupffer cells up to the development of haemangioendotheliomata, as demonstated histochemically and autoradiographically with 35S. The alterations in the liver parenchyma may be subdivided into three stages: the first stage lasts until the third month of the experiment and shows a “non-specific” destruction of single cells due to the initial toxicity of the carcinogen and to a reactive, increased proliferation of parenchyma cells. In the second stage, lasting until the fifth month, there appeared to be an adaptation of the cells to chronic metabolic stress. In the third stage, mainly in the eight and ninth months, four focally appearing types of cells can be demonstrated and differentiated by their size, nuclear size, basophilia and glycogen content. Current methods of investigations do not indicate from which cells the tumours originate. Bei wöchentlicher intravenöser Applikation von 20 mg Methyl-Allyl-Nitrosamin/kg Körpergewicht entwickelten sich bei allen Versuchstieren Lebercirrhosen und 9 Monate nach Versuchsbeginn Hämangioendotheliome und Hepatome. Bei den Lebercirrhosen lag der Ausgangspunkt der Mesenchymproliferation im Läppchenzentrum. Sie beruhte auf einer histochemisch und autoradiographisch mit 35S nachgewiesenen Aktivierung von Fibroblasten und v. Kupfferschen Sternzellen bis zur Entwicklung von Hämangioendotheliomen. Die Veränderungen am Leberparenchym können in drei Stadien eingeteilt werden: Das erste Stadium reicht bis zum 3. Monat nach Versuchsbeginn und zeigt einen “unspezifischen” durch initiale toxische Wirkung des Carcinogens bedingten Einzelzelluntergang mit reaktiv gesteigerter Zellproliferation. Im zweiten bis zum fünften Monat reichenden Stadium ist eine Adaptation der Zellen an die chronische Stoffwechselbelastung anzunehmen. Im dritten Stadium sind vor allem im 8. und 9. Versuchsmonat vier herdweise auftretende Zelltypen nachweisbar, die durch Zell- und Kerngröße, durch Basophilie und durch den Glykogengehalt unterschieden sind. Aus welchen der verschiedenen Zelltypen sich die Tumoren entwickeln ist mit den heute zur Verfügung stehenden Untersuchungsmethoden nicht zu entscheiden.

Die Anwendung flüssiger Emulsionen bei autoradiographischen Untersuchungen mit H3-markierten Substanzen

ZusammenfassungIn der Arbeit wird die Anwendung flüssiger Emulsionen in Gel-Form bei der Herstellung von Autoradiogrammen zum Nachweis H3-markierter Substanzen beschrieben.Die Vor- und Nachteile von Emulsionen unterschiedlicher Empfindlichkeit und verschiedenen Silberkorndurchmessers werden besprochen.An Hand von Abbildungen kann gezeigt werden, daß mit flüssigen Emulsionen bei leichterer Anwendbarkeit und zeitsparender Technik die gleichen Ergebnisse erhalten werden können wie mit der Stripping-Film-Technik.

DYSKERATOSIS IN BOWEN'S DISEASE: THE ULTRASTRUOTURE AND FATE OF KERATINOCYTES WITH ALTERED TONO‐FILAMENT‐DESMOSOME COMPLEXES

Summary.— The ultrastructure of dyskeratotic cells in Bowens disease has been studied. It has been found that, in the suprabasal layers in some keratino‐cytes, all tonofilament‐desmosome complexes (TFDC), as well as many cytoplasmic organelles, are altered. The earliest stage of TFDG alteration con‐sisted in the separation and retraction of tonofilaments from the desmosomes. The consequence of this was the disappearance of the desmosomes and acantholytic separation of the involved keratinocyte. Our findings indicate that this was followed by the disintegration of the involved keratinocyte apart from the tonofilaments. These were released into the intercellular space and finally into the corium through breaks In the basal lamina. The Langerhans and some other dendritic epidermal cells are likely to play a role in the latter process.

Das Verteilungs- und Einbaumuster radioaktiv markierter Carcinogene in der Museepidermis nach lokaler Applikation

In autoradiographischen Untersuchungen nach lokaler Applikation von 3H-Benzpyren und 3H-Methylcholanthren konnte nachgewiesen werden, das die Carcinogene selbst oder aber ihre markierten Abbauprodukte fest in Protein, Ribonucleinsauren und Desoxyribonucleinsauren der verschiedenen Zellelemente der Mauseepidermis eingebaut werden. Das Markierungsmuster der untersuchter teils hyperplastischen, teils normalen Mausehaut entspricht weitgehend dem Incorporationsmuster, welches nach Applikation markierter Aminosauren erhalten wird. Mit zunehmender Versuchszeit erfolgt im mehrschichtigen Plattenepithel eine Verschiebung der radioaktiven Markierung nach der Gewebsoberflache hin. Die Eliminierung des Carcinogens erfolgt somit mit groster Wahrscheinlichkeit durch die im Zuge der phyliologischen Regeneration stattfindende Zellabstosung. Da 4–10 Tage nach einmaliger Applikation auch in den basalen Zellagen keine markierten Carcinogene mehr nachweisbar sind, mus angenommen werden, das die carcinogene Wirkung der untersuchten Substanzen nicht auf einem dauernden Einbau der Substanzen, sondern auf der irreversiblen Veranderung bestimmter Zellstrukturen beruht.In autoradiographischen Untersuchungen nach lokaler Applikation von 3H-Benzpyren und 3H-Methylcholanthren konnte nachgewiesen werden, daß die Carcinogene selbst oder aber ihre markierten Abbauprodukte fest in Protein, Ribonucleinsäuren und Desoxyribonucleinsäuren der verschiedenen Zellelemente der Mäuseepidermis eingebaut werden. Das Markierungsmuster der untersuchter teils hyperplastischen, teils normalen Mäusehaut entspricht weitgehend dem Incorporationsmuster, welches nach Applikation markierter Aminosäuren erhalten wird. Mit zunehmender Versuchszeit erfolgt im mehrschichtigen Plattenepithel eine Verschiebung der radioaktiven Markierung nach der Gewebsoberfläche hin. Die Eliminierung des Carcinogens erfolgt somit mit größter Wahrscheinlichkeit durch die im Zuge der phyliologischen Regeneration stattfindende Zellabstoßung. Da 4–10 Tage nach einmaliger Applikation auch in den basalen Zellagen keine markierten Carcinogene mehr nachweisbar sind, muß angenommen werden, daß die carcinogene Wirkung der untersuchten Substanzen nicht auf einem dauernden Einbau der Substanzen, sondern auf der irreversiblen Veränderung bestimmter Zellstrukturen beruht. In autoradiographic studies after the local application of H3-benzpyrene and H3-methylcholanthrene it could be demonstrated that the carcinogens themselves or their labelled breakdown products were bound firmly into the proteins, ribonucleic acids, and deoxyribonucleic acids of the various cells of the mouse epidermis. The pattern oflabelling of the skin studied, which in part was hyperplastic, in part normal, corresponded greatly with the pattern of incorporation which was obtained after the application of labelled amino acids. As the experimental period increased, there was a displacement of the radioactive labelling towards the surface of the stratifield squamous epithelium. Consequently, it seemed most probable that the carcinogens were eliminated by means of the cellular desquamation during the process of physiologic regeneration. Since labelled carcinogens were not demonstrable in the basal cell layers from four to ten days after single applications, it must be assumed that the carcinogenic action of the substances investigated does not depend on a lasting uptake of substances, but on the irreversible changes of certain cellular structures.

Das Verteilungsmuster und die Verweildauer radioaktiv markierter carcinogener und nichtcarcinogener polycyclischer Kohlenwasserstoffe in der Mäuse- und Rattenhaut

In autoradiographischen Untersuchungen an der Mäusehaut wurde das Verteilungs-und Einbaumuster nichtcarcinogenen 3H-1,2-Benzpyrens und 3H-1,2,3,4-Dibenzanthracens mit dem der carcinogenen Kohlenwasserstoffe 3,4,-Benzpyren-H3 und 20-Methylcholanthren-H3 verglichen. Die nichtcarcinogenen Stoffe ergaben eine wesentlich geringere Silberkorndichte im Autoradiogramm und zeigten neben einem geringeren Eindringvermögen in die Mäusehaut eine raschere Eliminierung. Unterschiede im Einbaumuster konnten aber nicht entdeckt werden. Das Verteilungsmuster von 3,4-Brenzpyren-H3 in der Haut der Ratte glich im wesentlichen dem der Maus. Die Eliminierung der Radioaktivität verlief aber rascher, so daß schon 24 Std nach der letzten Tropfung ein großer Teil der Silberkornbelegung verschwunden und die Epidermis nach 48 Std praktisch frei von Markierung war, obwohl die applizierte Radioaktivitätsmenge und die anfängliche Intensität der Schwärzung bei Ratte und Maus die gleiche waren. Die durch die toxische Wirkung des Carcinogens hervorgerufenen entzündlichen Reaktionen scheinen für die schlechte Cancerisierbarkeit der Rattenhaut bei lokaler Applikation mit verantwortlich zu sein. Nach lokaler Applikation von 3,4-Benzpyren-H3 und 20-Methylcholanthren-H3 auf die Mäusehaut konnte ein Teil der Radioaktivität bis 4 Tage nach der letzten Tropfung in der Leber und den Nieren nachgewiesen werden. Das Verteilungs-muster entspricht weitgehend dem Inkorporationsmuster, welches nach Applikation mit markierter Aminosäuren erhalten wird. In radioautographic investigations the patterns of distribution and incorporation of non-carcinogenic H3-1,2,3-Dibenzanthracene and H3-1,2-Benzpyrene was compared with that of the carcinogenic H3-3,4-Benzpyrene and H3-20-Methyl-cholanthrene in mouse skin. The non-carcinogenic substances showed much less uptake, their ability to enter the mouse skin was diminished and they were eliminated faster. There were no differences of the pattern of uptake, however. The pattern of distribution of H3-3,4-Benzpyrene in rat skin was about equal to that of mouse skin. The elimination of radioactivity, however, ensued faster, for 24 h after the last application a large amount of radioactivity had disappeared. The epidermis was practically free of labelling 48 h after application, although the amount of labelled carcinogen used and the initial intensity of incorporation were equal in rat and mouse. The inflammatory reactions caused by the toxic effect of carcinogens appear to be responsible for the poorer carcinogenesis by rat skin after local applications. After H3-3,4-Benzpyrene and H3-20-Methylcholanthrene were applied on mouse skin, some radioactivity could be demonstrated in the liver and kidneys up to 4 days. The incorporation-pattern of the investigated carcinogenic hydrocarbons corresponds closely with the incorporation-pattern after application of labelled amino acids.

Electron microscopic studies on the small intestinal mucosa of rats after mechanical intestinal obstruction and ischemia.

SummaryUltrastructural changes in the small intestine during the early phase following mechanical obstruction were compared with those after vascular ligation. In both experiments (the early phase of mechanical ileus and ischemia) intestinal epithelial cells at the tips of villi showed common features. One of the most significant changes was an alteration in microvilli, with fragmentation into vesicles, narrowing of apical microvilli and decrease in number. The other change was fatty degeneration of the epithelial cells, which was accompanied by vesiculation of smooth endoplasmic reticulum beneath the terminal webs, fat deposition and dilated Golgi complex containing fat. These observations suggest that in the early phase of mechanical ileus, ischemic damage plays an important role.

Die Gre und der zeitliche Verlauf der RNS-Synthese in den Ehrlich-Ascites-Tumorzellen der weien Maus

Am Ehrlichschen Ascites-Carcinom auf weißen männlichen Inzuchtmäusen wurde unter Verwendung von H-3-Cytidin die Größe und der zeitliche Verlauf der RNS-Synthese autoradiographisch untersucht. Die quantitative Auswertung der Autoradiogramme ergab ein Maximum des Cytidin-Einbaus bei 15 min in Kern und Nucleolus, dem ein langsamer kontinuierlicher Abfall bis zu 36 Std folgte, wahrend das Cytoplasma eine Zunahme der Markierung von der 1. bis zur 12. Std mit anschließendem Abfall erkennen ließ. Bei den Zellen des Ascites-Carcinoms haben also Nucleolus und Chromatin als primäre RNS-Syntheseorte zu gelten. Dabei ist die synthetische Aktivität pro Volumeneinheit im Nucleolus etwa zweimal größer als im übrigen Kern. Im Gegensatz zu den anderen Köroperzellen erfolgt bei der Zelle des Ascites-Carcinoms anscheinend auch während der Mitose eine RNS-Synthese. Using H-3-Cytidine the quantity and mode of the RNA synthesis in the Ehrlich ascites carcinoma was studied autoradiographically in inbred, male, albino mice. The quantitative evaluation of the autoradiograms showed a maximal uptake of Cytidine within 15 minutes in the nucleus and nucleolus, following which there was a slow, continuous fall to 36 hours. In the cytoplasm an increase of the labelling could be detected from the 1st to the 12th hour with an ultimate decrease. The nucleolus and chromatin in the cells of the ascites carcinoma are the primary site of RNA synthesis. The synthetic activity pro unit volume in the nucleolus is about two times greater than in the remainder of the nucleus. In contrast with the other cells of the body, the cell of the ascites carcinoma shows RNA synthesis during mitoses.