Walter Sandritter

Zur Kinetik der Feulgenreaktion bei verlngerter Hydrolysezeit Cytophotometrische Messungen im sichtbaren und ultravioletten Licht

ZusammenfassungMit der Methode der Langzeithydrolyse (HCl, pH 1,2, 37°) wurde in zytophotometrischen Untersuchungen die Kinetik der Feulgenreaktion an verschiedenen Zelltypen in Kombination mit dem Nachweis von Phosphatgruppen (Gallocyaninchromalaunfärbung), Basen der Nukleinsäuren (UV-Photometrie) und der Doppelbrechung untersucht. Unter den gewählten Hydrolysebedingungen können 3 Phasen der Feulgenreaktion unterschieden werden:1.Die Freisetzung und gleichzeitige Lösung von Aldehydgruppen bis zum Hydrolysemaximum, die mit einer Depolymerisation der DNS, Verminderung von Phosphatgruppen und Herauslösung von Basen der DNS einhergeht.2.Eine stationäre Phase, in der niedermolekulare Bruchstücke der DNS in heterochromatischen, Zucker und Phosphat enthaltenden Chromozentren der Zellkerne vorliegen.3.Eine Phase der langsamen Lösung dieser Abbauprodukte. Morphologische Untersuchungen zeigen, daß Eu- und Heterochromatin eine verschiedene Säureempfindlichkeit aufweisen, wobei das Euchromatin die Aldehydgruppen rasch freisetzt, die nach Überschreiten des Hydrolysemaximums in Lösung gehen, während das Heterochromatin relativ säureresistent ist und für die Anfärbung der Zellkerne in der stationären 2. Phase verantwortlich ist.

Untersuchungen an teilungssynchronen L-Zellen

SummaryPreferential detachment of dividing cells from a monolayer of confluent L-cells is used as a method to synchronize cells. 95% of the selected cells are in mitosis. Purity of the cell preparation depends on the surface qualities of the glass, Ca++-Mg++ concentration in the medium, temperature, density of the monolayer and intensity of sheering force used. The cell preparation consists of 50% telophases, 20% metaphases, 10% anaphases, 10% prophases, 2% interphases and 3% pyknotic cells. Upon reimplantation 95% of these cells reach the 2. mitosis in a synchronous wave. Microcinematographic registration showed an average generation time of 22 hours±17,5%. Progressive desynchronization within one cycle is due to differences in generation time.ZnsammenfassungInfolge der geringen Haftbarkeit von Zellen während der Zellteilung können 95–98% Mitosezellen aus Monolayer-Kulturen gewonnen werden. Die Zusammensetzung der Glasoberfläche, Ca++-Mg++-Gehalt des Mediums, Temperatur, Dichte des Zellrasens und Stärke der Scherkräfte bestimmen die Reinheit des Präparates. Die Zellen bestehen aus etwa 50% Telophasen und 20% Metaphasen, 10% Anaphasen, 10% Prophasen, 2% Interphasen und 3% Pyknosen. Nach Wiedereinpflanzung durchlaufen 95% dieser Zellen einen ganzen Zellzyklus. Mikrokinematographisch wurde eine mittlere Generationszeit von 22 Std±17,5% ermittelt. Der Unterschied in der Generationszeit von Zelle zu Zelle und die damit verbundene progrediente Desynchronisierung ist der größte Nachteil bei der Verwendung dieses Zellsystems.

Eine cytophotometrische Methode zur Objektivierung der Morphologie von Zellkernen

SummaryA method for the objectivation of the morphology of Feulgen stained cell nuclei is presented. Cytophotometric measurements (scanning method) were used to obtain the optical density of chromatin particles. The particles were classified according to their optical density (Extinction level separation method).This classification of the nuclear chromatin particles reveals characteristic frequency distribution in different types of cell nuclei. Three classes of the cell nuclei may be distinguished.1.Small dense cell nuclei in which 70% of the extinction values fall into the highest extinction level class while 30% belong to lower extinction levels (Thymus lymphocytes).2.Large cell nuclei (liver cells, mouse ascites tumor cells) in which 90% of the optical density values of the particles are arranged around a medium value showing the presence of an unimodal frequency distribution pattern.3.Medium-large cell nuclei (Thymus lymphoblasts, Kupffer cells), in which 2 populations of chromatin particles are found; one with a low and one with high extinction values. The possibility to use this method for quantitative estimation of Eu- and Heterochromatin is discussed.ZusammenfassungEs wird eine cytophotometrische Methode zur Objektivierung des morphologischen Erscheinungsbildes von feulgengefärbten Zellkernen angegeben. Nach photometrischer Abtastung der Zellkerne werden die Chromatinpartikel nach ihrem Farbstoffgehalt in verschiedene Extinktionsstufen eingeordnet. Diese Klassifizierung des Kernchromatins ergibt für verschiedene Typen von Zellkernen unterschiedliche Häufigkeitsverteilungen in verschiedenen Extinktionsstufen. Es können drei Klassen von Zellkernen unterschieden werden.1.Kleine dichte Zellkerne, bei denen 70% der Werte in der höchsten Extinktionsstufe liegen und 30% niedrigeren Extinktionsstufen angehören (Thymuslymphozyten).2.Große Zellkerne (Leberzellen, Mäuseascitestumorzellen), bei denen 90% der Extinktionswerte einer einheitlichen mittleren Extinktionsstufe angehören (unimodale Verteilung der Partikelextinktion).3.Mittelgroße Zellkerne (Thymuslymphoblasten, Kupffersche Sternzellen), bei denen zwei Populationen von Chromatinpartikeln, solche mit niedrigen und solche mit hohen Extinktionswerten auftreten. Es wird diskutiert, inwieweit diese Methode für die Mengenbestimmung von Eu- und Heterochromatin benutzt werden kann.

Zur Problematik der Gewebspräparation für cytophotometrische Messungen

SummaryBased on experimental results the author describes various methods for the preparation of tissue for cytophotometric investigations. The problem of DNA-measuring in cell nuclei, the measuring of homogeneous objects, and the measuring of cytoplasmic substances in tissue sections are investigated under various aspects. A special squashing technique for the preparation of complete cells from the central nervous system is described.ZusammenfassungAufgrund eigener experimenteller Erfahrungen werden die verschiedenen Methoden der Gewebspräparation für cytophotometrische Zwecke beschrieben. Ausgehend von verschiedenen Fragestellungen wird das Problem der DNS-Messungen an Zellkernen, die Messungen an homogenen Objekten und die Frage der Messungen an cytoplasmatischen Substanzen in Gewebsschnitten behandelt. Es wird eine Quetschtechnik zur Präparation ganzer Zellen speziell für das ZNS beschrieben.

Versuche zur Carcinogenese in vitro

Die Zellpopulationen von sieben Rattenfibroblastenstämmen entwickelten nach einer etwa einjährigen Phase der Instabilität Chromosomenstammlinien, die entweder aneuploid oder pseudodiploid waren. Dabei tritt eine Vergröberung des Kernchromatins mit größeren heterochromatischen Bezirken auf. Nach Entwicklung der Stammlinien lassen sich die Zellpopulationen häufig auf Ratten transplantieren. Diese Fähigkeit, als solide Tumoren zu wachsen, wird als Zeichen der malignen Transformation angesehen. Bei jedem Milieuwechsel (Übertragung auf Versuchstiere, Reexplantation in die Kultur) können Änderungen der Chromosomen-und DNS-Stammlinien auftreten. After about one year of instability, the cell populations of 7 strains of rat fibroblasts developed chromosome lines which were either aneuploid or pseudodiploid. With these changes a coarseness of the nuclear chromatin appeared with large heterochromatic regions. After the development of the stemline, the cell populations often could be transplanted into rats. This capability to grow as solid tumors is regarded as a sign of malignant transformation. With each change of milieu (transplantation to experimental animals, re-explantation into the in vitro culture) changes of the chromosome- und DNA-stemline may appear.Die Zellpopulationen von sieben Rattenfibroblastenstammen entwickelten nach einer etwa einjahrigen Phase der Instabilitat Chromosomenstammlinien, die entweder aneuploid oder pseudodiploid waren. Dabei tritt eine Vergroberung des Kernchromatins mit groseren heterochromatischen Bezirken auf. Nach Entwicklung der Stammlinien lassen sich die Zellpopulationen haufig auf Ratten transplantieren. Diese Fahigkeit, als solide Tumoren zu wachsen, wird als Zeichen der malignen Transformation angesehen. Bei jedem Milieuwechsel (Ubertragung auf Versuchstiere, Reexplantation in die Kultur) konnen Anderungen der Chromosomen-und DNS-Stammlinien auftreten.

Sukzedane Zytophotometrische Bestimmung von Desoxyribonukleinsäure, Histon und Gesamtprotein

SummaryA sequential cytophotometric determination of DNA, total protein and histone protein using simultaneous Feulgen-Naphthol yellow staining followed by Fastgreenstaining, was examined and there was no difference between successive stained cells and controls. Formalinfixation is to prefer.ZusammenfassungDie aufeinanderfolgende Anwendung der simultanen Feulgen-Naphtholgelbfärbung und der Fastgreenfärbung bei pH 8,2 zur Bestimmung von DNS, Gesamtprotein und Histonprotein wird geprüft. Im Vergleich zu Kontrollen ergaben sich identische Meßergebnisse. Die Formalinfixierung ist am besten geeignet.

Zytophotometrische Bestimmungen des DNS-Gehaltes von Zellkernen des Nebennierenmarkes, der Nebennierenrinde und der Schilddrse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen

SummaryConcerning the functional DNA changes the DNA content of the cell nuclei was defined cytophotometrically under the reaction of the following different experimental conditions at rat organs: li2.within the region of Zona glomerulosa, Zona fasciculata, Zona reticularis of the suprarenal gland cortex after the use of ACTH, respectively after a cortison therapy,3.in the thyroid gland after the use of thyroxin, TSH respectively low temperature shock. The DNA content per cell nucleus remains constantly in the different organs in all experimental conditions. An increase of the mean values of the DNA content is dependent on the S-phase cell nuclei in the suprarenal gland and in the thyroid gland (TSH respectively cold). The result of this investigation is in contradiction to the results of other authors who found functional DNA changes in the same organs under the equal experimental conditions. The cause of this discrepancy could not be explained.ZusammenfassungZur Frage funktioneller DNS-Veränderungen wurde der DNS-Gehalt von Zellkernen unter dem Einfluß folgender verschiedener experimenteller Bedingungen an Rattenorganen zytophotometrisch bestimmt:1.im Nebennierenmark nach intermittierender Kälteeinwirkung (300 Std),2.im Bereich der Zona glomerulosa, Zona fasciculata, Zona reticularis der Nebennierenrinde nach ACTH bzw. Cortisonbehandlung,3.in der Schilddrüse nach Thyroxin, TSH bzw. Kältebehandlung. Unter sämtlichen Versuchsbedingungen blieb die DNS-Menge pro Zellkern in den verschiedenen Organen konstant. Eine Erhöhung der Mittelwerte des DNS-Gehaltes in Nebennieren (ACTH) und Schilddrüsen (TSH bzw. Kälte) ist durch S-Phasenzellkerne bedingt. Das Ergebnis dieser Untersuchungen steht in Widerspruch zu den Befunden anderer Autoren, die unter denselben Versuchsbedingungen in den gleichen Organen funktionelle DNS-Veränderungen gefunden haben. Die Ursache dieser Diskrepanz konnte nicht geklärt werden.Zur Frage funktioneller DNS-Veranderungen wurde der DNS-Gehalt von Zellkernen unter dem Einflus folgender verschiedener experimenteller Bedingungen an Rattenorganen zytophotometrisch bestimmt: 1. im Nebennierenmark nach intermittierender Kalteeinwirkung (300 Std), 2. im Bereich der Zona glomerulosa, Zona fasciculata, Zona reticularis der Nebennierenrinde nach ACTH bzw. Cortisonbehandlung, 3. in der Schilddruse nach Thyroxin, TSH bzw. Kaltebehandlung. Unter samtlichen Versuchsbedingungen blieb die DNS-Menge pro Zellkern in den verschiedenen Organen konstant. Eine Erhohung der Mittelwerte des DNS-Gehaltes in Nebennieren (ACTH) und Schilddrusen (TSH bzw. Kalte) ist durch S-Phasenzellkerne bedingt.

A Method for the Quantitative Evaluation of Eu- and Heterochromatin in Interphase Nuclei using Cytophotometry and Pattern Analysis

Summary The method described herein for the quantitative evaluation of the amount of eu- and heterochromatin in a single interphase cell nucleus is based upon the measurement of optical density in Feulgen-stained nuclei with a scanning cytophotometer (UMSP I). The digitalized values for each grid point are entered via punched paper tape into a computer and processed therein. The position and optical density level of the grid points serve as criteria for the recognition of heterochromatin. The computer calculates the total DNA content of all such points, as well as the proportion of this heterochromatin DNA with respect to the entire DNA content of the cell nucleus. The heterochromatin contents so obtained agree with values obtained from a densitometric determination from photographs of cell nuclei. Agreement with cytogenetic experiments is also observed. The applicability of the method is demonstrated for the heterochromatin content of a variety of rodent species.

Cytophotometric determination of the binding of basic dyes by DNA following acetylation

SummaryDNA was removed from various tissues by histochemical acetylation of amino groups in proteins using pure acetic anhydride, as demonstrated by cytophotometric (UV, Feulgen, gallocyanin chromalum) and biochemical techniques. Since new phosphate groups were simultaneously exposed, the intensity of methylene blue staining was increased in spite of the nucleic acid release. Under conditions where no extraction occurs the staining intensity increases for more than 30 per cent. On the other hand, the staining intensity of gallocyanin chromalum kept constant. As it had been demonstrated previously, that gallocyanin chromalum binds to about 86 per cent of the DNA phosphate groups, it was concluded that this dye binds to a higher percentage of phosphate groups than do the usual basic dyes. Since it is not possible under the conditions used to make all nucleic acid phosphate groups available for basic dye binding by blocking the amino groups of proteins it can be assumed that not only electrostatic, but also spatial and steric relationships influence the binding capacity of basic dyes to the phosphate groups of nucleoproteins.

ber den quantitativen histochemischen Nachweis von basischen Kernproteinen mit Gallocyaninchromalaun

ZusammenfassungEs wird eine Technik entwickelt, um basische Proteine der Zellkerne nach Anlagerung von Metaphosphorsäure mit basischen Farbstoffen nachzuweisen. Die Ergebnisse wurden mit der Fastgreenfärbung pH 8,2 und biochemischen Daten verglichen. Die Metaphosphorsäure-Gallocyaninchromalaunfärbung ergibt an Bullenspermien, Thymuslymphozyten und Hühnererythrozyten (Ausnahme Forellenerythrozyten) gleiche Meßwerte wie die Fastgreenfärbung. Nach Desaminierung (Nachweis von Arginin) stimmen die zytophotometrischen Ergebnisse beider Färbungen gut mit den biochemischen Werten überein. Bei sukzedaner Färbung mit Gallocyaninchromalaun (bzw. Toluidinblau oder Fluoreszenzfärbungen) und nachfolgender Metaphosphorsäure-Gallocyaninchromalaunfärbung wird eine erhöhte Farbstoffbindung beobachtet, die auf einer unspezifischen An-färbung (Anlagerung an die DNS ?) beruht.Es wird eine Technik entwickelt, um basische Proteine der Zellkerne nach Anlagerung von Metaphosphorsaure mit basischen Farbstoffen nachzuweisen. Die Ergebnisse wurden mit der Fastgreenfarbung pH 8,2 und biochemischen Daten verglichen. Die Metaphosphorsaure-Gallocyaninchromalaunfarbung ergibt an Bullenspermien, Thymuslymphozyten und Huhnererythrozyten (Ausnahme Forellenerythrozyten) gleiche Meswerte wie die Fastgreenfarbung. Nach Desaminierung (Nachweis von Arginin) stimmen die zytophotometrischen Ergebnisse beider Farbungen gut mit den biochemischen Werten uberein. Bei sukzedaner Farbung mit Gallocyaninchromalaun (bzw. Toluidinblau oder Fluoreszenzfarbungen) und nachfolgender Metaphosphorsaure-Gallocyaninchromalaunfarbung wird eine erhohte Farbstoffbindung beobachtet, die auf einer unspezifischen An-farbung (Anlagerung an die DNS ?) beruht.