G. Kiefer

Eine cytophotometrische Methode zur Objektivierung der Morphologie von Zellkernen

SummaryA method for the objectivation of the morphology of Feulgen stained cell nuclei is presented. Cytophotometric measurements (scanning method) were used to obtain the optical density of chromatin particles. The particles were classified according to their optical density (Extinction level separation method).This classification of the nuclear chromatin particles reveals characteristic frequency distribution in different types of cell nuclei. Three classes of the cell nuclei may be distinguished.1.Small dense cell nuclei in which 70% of the extinction values fall into the highest extinction level class while 30% belong to lower extinction levels (Thymus lymphocytes).2.Large cell nuclei (liver cells, mouse ascites tumor cells) in which 90% of the optical density values of the particles are arranged around a medium value showing the presence of an unimodal frequency distribution pattern.3.Medium-large cell nuclei (Thymus lymphoblasts, Kupffer cells), in which 2 populations of chromatin particles are found; one with a low and one with high extinction values. The possibility to use this method for quantitative estimation of Eu- and Heterochromatin is discussed.ZusammenfassungEs wird eine cytophotometrische Methode zur Objektivierung des morphologischen Erscheinungsbildes von feulgengefärbten Zellkernen angegeben. Nach photometrischer Abtastung der Zellkerne werden die Chromatinpartikel nach ihrem Farbstoffgehalt in verschiedene Extinktionsstufen eingeordnet. Diese Klassifizierung des Kernchromatins ergibt für verschiedene Typen von Zellkernen unterschiedliche Häufigkeitsverteilungen in verschiedenen Extinktionsstufen. Es können drei Klassen von Zellkernen unterschieden werden.1.Kleine dichte Zellkerne, bei denen 70% der Werte in der höchsten Extinktionsstufe liegen und 30% niedrigeren Extinktionsstufen angehören (Thymuslymphozyten).2.Große Zellkerne (Leberzellen, Mäuseascitestumorzellen), bei denen 90% der Extinktionswerte einer einheitlichen mittleren Extinktionsstufe angehören (unimodale Verteilung der Partikelextinktion).3.Mittelgroße Zellkerne (Thymuslymphoblasten, Kupffersche Sternzellen), bei denen zwei Populationen von Chromatinpartikeln, solche mit niedrigen und solche mit hohen Extinktionswerten auftreten. Es wird diskutiert, inwieweit diese Methode für die Mengenbestimmung von Eu- und Heterochromatin benutzt werden kann.

Zur Problematik der Gewebspräparation für cytophotometrische Messungen

SummaryBased on experimental results the author describes various methods for the preparation of tissue for cytophotometric investigations. The problem of DNA-measuring in cell nuclei, the measuring of homogeneous objects, and the measuring of cytoplasmic substances in tissue sections are investigated under various aspects. A special squashing technique for the preparation of complete cells from the central nervous system is described.ZusammenfassungAufgrund eigener experimenteller Erfahrungen werden die verschiedenen Methoden der Gewebspräparation für cytophotometrische Zwecke beschrieben. Ausgehend von verschiedenen Fragestellungen wird das Problem der DNS-Messungen an Zellkernen, die Messungen an homogenen Objekten und die Frage der Messungen an cytoplasmatischen Substanzen in Gewebsschnitten behandelt. Es wird eine Quetschtechnik zur Präparation ganzer Zellen speziell für das ZNS beschrieben.

Versuche zur Carcinogenese in vitro

Die Zellpopulationen von sieben Rattenfibroblastenstämmen entwickelten nach einer etwa einjährigen Phase der Instabilität Chromosomenstammlinien, die entweder aneuploid oder pseudodiploid waren. Dabei tritt eine Vergröberung des Kernchromatins mit größeren heterochromatischen Bezirken auf. Nach Entwicklung der Stammlinien lassen sich die Zellpopulationen häufig auf Ratten transplantieren. Diese Fähigkeit, als solide Tumoren zu wachsen, wird als Zeichen der malignen Transformation angesehen. Bei jedem Milieuwechsel (Übertragung auf Versuchstiere, Reexplantation in die Kultur) können Änderungen der Chromosomen-und DNS-Stammlinien auftreten. After about one year of instability, the cell populations of 7 strains of rat fibroblasts developed chromosome lines which were either aneuploid or pseudodiploid. With these changes a coarseness of the nuclear chromatin appeared with large heterochromatic regions. After the development of the stemline, the cell populations often could be transplanted into rats. This capability to grow as solid tumors is regarded as a sign of malignant transformation. With each change of milieu (transplantation to experimental animals, re-explantation into the in vitro culture) changes of the chromosome- und DNA-stemline may appear.Die Zellpopulationen von sieben Rattenfibroblastenstammen entwickelten nach einer etwa einjahrigen Phase der Instabilitat Chromosomenstammlinien, die entweder aneuploid oder pseudodiploid waren. Dabei tritt eine Vergroberung des Kernchromatins mit groseren heterochromatischen Bezirken auf. Nach Entwicklung der Stammlinien lassen sich die Zellpopulationen haufig auf Ratten transplantieren. Diese Fahigkeit, als solide Tumoren zu wachsen, wird als Zeichen der malignen Transformation angesehen. Bei jedem Milieuwechsel (Ubertragung auf Versuchstiere, Reexplantation in die Kultur) konnen Anderungen der Chromosomen-und DNS-Stammlinien auftreten.

A Method for the Quantitative Evaluation of Eu- and Heterochromatin in Interphase Nuclei using Cytophotometry and Pattern Analysis

Summary The method described herein for the quantitative evaluation of the amount of eu- and heterochromatin in a single interphase cell nucleus is based upon the measurement of optical density in Feulgen-stained nuclei with a scanning cytophotometer (UMSP I). The digitalized values for each grid point are entered via punched paper tape into a computer and processed therein. The position and optical density level of the grid points serve as criteria for the recognition of heterochromatin. The computer calculates the total DNA content of all such points, as well as the proportion of this heterochromatin DNA with respect to the entire DNA content of the cell nucleus. The heterochromatin contents so obtained agree with values obtained from a densitometric determination from photographs of cell nuclei. Agreement with cytogenetic experiments is also observed. The applicability of the method is demonstrated for the heterochromatin content of a variety of rodent species.

Cytophotometric determination of the binding of basic dyes by DNA following acetylation

SummaryDNA was removed from various tissues by histochemical acetylation of amino groups in proteins using pure acetic anhydride, as demonstrated by cytophotometric (UV, Feulgen, gallocyanin chromalum) and biochemical techniques. Since new phosphate groups were simultaneously exposed, the intensity of methylene blue staining was increased in spite of the nucleic acid release. Under conditions where no extraction occurs the staining intensity increases for more than 30 per cent. On the other hand, the staining intensity of gallocyanin chromalum kept constant. As it had been demonstrated previously, that gallocyanin chromalum binds to about 86 per cent of the DNA phosphate groups, it was concluded that this dye binds to a higher percentage of phosphate groups than do the usual basic dyes. Since it is not possible under the conditions used to make all nucleic acid phosphate groups available for basic dye binding by blocking the amino groups of proteins it can be assumed that not only electrostatic, but also spatial and steric relationships influence the binding capacity of basic dyes to the phosphate groups of nucleoproteins.

Quantitative histochemische Untersuchungen über die säurefeste Anfärbung des Spermienkopfes

Die bei der sog. saurefesten Farbung im Spermienkopf enthaltene Kristallviolettmenge kann quantitativ mit cytophotometrischen Methoden bestimmt werden. Eine Fixierung mit abs. Alkohol und Farbung bei pH 7,5 ergab eine fur quantitative Zwecke optimale Anfarbung. Die gebundene Kristallviolettmenge ist der DNS-Menge des Spermiums proportional. Es wird vermutet, das die saurefeste Farbung auf einer Bindung des Kristallvioletts an die Phosphatgruppen der Nukleinsauren beruht und das die spezielle Anordnung der Nukleoproteine im Spermium eine wesentliche Rolle spielt.ZusammenfassungDie bei der sog. säurefesten Färbung im Spermienkopf enthaltene Kristallviolettmenge kann quantitativ mit cytophotometrischen Methoden bestimmt werden. Eine Fixierung mit abs. Alkohol und Färbung bei pH 7,5 ergab eine für quantitative Zwecke optimale Anfärbung. Die gebundene Kristallviolettmenge ist der DNS-Menge des Spermiums proportional. Es wird vermutet, daß die säurefeste Färbung auf einer Bindung des Kristallvioletts an die Phosphatgruppen der Nukleinsäuren beruht und daß die spezielle Anordnung der Nukleoproteine im Spermium eine wesentliche Rolle spielt.

Cytophotometrische Messungen des DNS-Gehaltes von Affennieren-Zellkulturen nach Infektion mit Adenovirus Typ 3

Using Feulgen - stained preparations the DNA content of adenovirus infected cells of monkey kidneys (cultured in vitro) was determined by cytophotometry. The DNA content of nuclei with inclusion bodies was found to be 5 to 10 times higher than that of nuclei without inclusions. It is assumed that the inclusion bodies consist of masses of virus particles whose DNA is bound to a protein which differs from the histones of the cell nuclei. The alteration of shape of the inclusion bodies is to be observed only after the completed synthesis of virus particles.