Werner Schäfer

Vergleichende sero-immunologische Untersuchungen über die Viren der Influenza und klassischen Geflügelpest

Zwischen dem Virus der klassischen Geflügelpest und Vertretern des Α-Typs der Influenza bestehen sero-immunologische Beziehungen, die mit Hilfe der Komplementbindungs-Probe und des Kreuzimmunisierungs-Versuches festgestellt wurden, durch den Präzipitations-, Hämagglutinations-Hemmungs- und Neutralisations-Versuch aber nicht nachzuweisen waren. Die serologische Untersuchung der Spaltprodukte des Influenza-FM/1- und Geflügelpest-Virus ergab, daß die antigene Komponente, die beiden Erregern gemeinsam ist, im „gebundenen Antigen“ der Virus-Elementarteilchen ihren Sitz hat. An Hand dieser Feststellung wurde eine Erklärung für den unterschiedlichen Ausgang der verschiedenen sero-immunologischen Reaktionen gesucht. Ebenso wie die Influenza-Viren ließ sich auch das Geflügelpest-Virus durch intranasale Impfung auf die Lunge der weißen Maus übertragen. Es wurde auf diese Weise bisher in 14 Passagen fortgeführt. Die Viren der Influenza und klassischen Geflügelpest sind auf Grund der Übereinstimmungen, die sie in physikalisch-chemischer und sero-immunologischer Hinsicht zeigen, nunmehr endgültig in eine Gruppe einzuordnen.

Ultrahistologische Studie über die Vermehrung des Virus der klassischen Geflügelpest

Die Vermehrung des Geflügelpest-Virus wurde in den Allantoiszellen des Hühnerembryos ultrahistologisch verfolgt. Dabei wurden insbesondere die Veränderungen studiert, die innerhalb der ersten 6 Stdn. nach der Infektion in Erscheinungen treten. Abweichungen vom normalen Bild ließen sich nur am freien Rand der Zellen feststellen. Hier treten in der 4.—5. Stde. nach der Infektion in vermehrtem Maße Protrusionen auf, die die Form von Bläschen und Filamenten haben. In der 6. Stde. nach der Infektion sind größere Mengen von Teilchen zu beobachten, die Virus-Elementarpartikeln ähnlich sehen. Diese entstehen durch Unterteilung der Filamente oder an deren freiem Ende und können wahrscheinlich auch in den bläschenförmigen Einheiten gebildet werden. Im Innern der Zellen wurden sie nicht beobachtet. Die an den infizierten Zellen gefundenen Gebilde werden mit den bisher isolierten virusspezifischen Einheiten verglichen. Ihre Bedeutung für die Virusvermehrung wird diskutiert.

Über den Aufbau des Virus-Elementarteilchens der klassischen Geflügelpest

Durch chemische Untersuchung hochgradig gereinigter Viruskonzentrate der klassischen Geflügelpest und der durch Ätherbehandlung aus ihnen gewonnenen Virus-Spaltprodukte wurde der Aufbau der infektiösen Virus-Elementareinheit aufzuklären versucht. Dabei ergab sich, daß die Elementareinheit außer Lipiden (etwa 24%) und einer noch nicht sicher erfaßten Menge von Kohlenhydraten, vor allem ein Nucleoproteid (etwa 63%) enthält. Die Nucleinsäure gehört sehr wahrscheinlich dem Pentosetyp an und macht etwa 4% der Trockenmasse des Elementarteilchens aus. Bei der Prüfung der Virus-Spaltprodukte wurde festgestellt, daß die gesamte Pentose-Nucleinsäure des Virus-Partikels in der als „gebundenes Antigen“ bezeichneten Untereinheit vorliegt, die in der Hauptsache aus Nucleoproteid besteht (etwa 15% Pentose-Nucleinsäure) und annähernd 25% der Masse des Elementarteilchens ausmacht. In der zweiten, in reiner Form gewonnenen, biologisch aktiven Untereinheit des Virus-Elementarpartikels, dem „Hämagglutinin“, wurden bisher nur Protein und Kohlenhydrate nachgewiesen. Sein Anteil am Aufbau des Elementarteilchens ließ sich noch nicht genau bestimmen. Das gebundene Antigen wird wegen seines hohen Pentose-Nucleinsäure-Gehaltes als das eigentliche selbstvermehrungs-fähige Material des Virus-Elementarteilchens angesprochen.

Eigenschaften tierischer Virusarten, untersucht an den Geflügelpestviren als Modell

In der isolierten Chorioallantois des Hühnerembryos vermehren sich die infektiösen Virusteilchen der klassischen Geflügelpest erst nach einer Latenzzeit von 3—5 Stunden. Die neue infektiöse Virusgeneration wird dann innerhalb verhältnismäßig kurzer Zeit gebildet. Während der Latenzzeit, in der die in die Wirtszellen eingedrungenen Virusteilchen in einer nichtinfektiösen Form vorzuliegen scheinen, vermehrt sich zuerst ein lösliches Antigen und dann ein Hämagglutinin. Es wird vermutet, daß das Hämagglutinin mit einer „unreifen Form“ identisch ist, die in Eihauthomogenisaten infizierter Hühnerembryonen nachgewiesen wurde. Sie unterscheidet sich von den vollaktiven Viruspartikeln dadurch, daß sie kleiner als diese und wahrscheinlich nicht infektiös ist.

Untersuchungen über das Virus der atypischen Geflügelpest

Das Virus der atypischen Geflügelpest wurde durch fraktionierte Zentrifugierung oder Fällung mit Ammonsulfat aus der Eiflüssigkeit bebrüteter Hühnereier rein dargestellt. Das isolierte Protein bewirkt noch in einer Menge von 10-14,88 g N eine 50-proz. Letalität der Hühnerembryonen und mit 3,6·10-8gN eine Hämagglutination. Es reagiert nicht mehr mit dem Antiserum gegen normales Eiprotein. gibt aber noch in hoher Verdünnung ein Präzipitat mit virusspezifischem Antiserum. Die immunisierende Wirkung der aus den Viruskonzentraten hergestellten Vaccinen ist im Kückenschutztest um ein Vielfaches höher als das des Ausgangsmaterials. Nach elektronenmikroskopischen Untersuchungen ergibt sich für das Virus in -Wasser eine runde Form, in salzhaltigen Lösungen ein mehr oder weniger gestreckter Faden. Messungen der Sedimentations- und Diffusionskonstanten des Virus in Wasser und Salzlösungen zeigen keine Veränderung des Formfaktors mit der Salzkonzentration. Es wird daher angenommen, daß die elektronenoptisch beobachtete Formwandlung bei der Präparation des Virus auf der Trägerfolie erfolgt. Die Sedimentationskonstante beträgt 1340 S, das Teilchengewicht 800·106. Die auf biologischem Wege für die Träger der Infektiosität und der hämagglutinierenden Wirkung bestimmte Sedimentationskonstante stimmt mit der optisch für das Protein beobachteten überein.

Isolierung und Charakterisierung hämagglutinierender, nicht-infektiöser Einheiten bei klassischer Geflügelpest

Aus infizierten Hühnerembryonen und ihren Eihäuten wurden Teilchen isoliert, die nichtinfektiös sind, aber virus-spezifische hämagglutinierende und antigene Wirksamkeit besitzen. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser als „inkomplette Formen“ bezeichneten Partikel wurden näher untersucht. Durch künstlichen Abbau von Virus-Elementarteilchen ließen sich keine Partikel gewinnen, die den „inkompletten Formen“ entsprechen.

Physikalisch-chemische und biologische Eigenschaften des gereinigten „löslichen Antigens“ der klassischen Geflügelpest

Das „lösliche Antigen“ der klassischen Geflügelpest ist ein kugelförmiges Teilchen mit einem Durchmesser von 10-15 mμ, das kettenförmige Aggregate bildet und nach seinem spektrophotometrischen Verhalten Nucleoproteid-Charakter hat. Es ist physikalisch-chemisch nicht von dem „gebundenen Antigen“ des Virus-Elementarteilchens zu unterscheiden. Auch serologisch bestehen enge Beziehungen zwischen den beiden Partikeln. Das „lösliche Antigen“ reagiert nur mit den virus-spezifischen Seren, mit denen auch das „gebundene Antigen“ eine Reaktion eingeht. Von Kaninchen-Serum gegen intakte Elementarteilchen werden beide nicht präzipitiert. Eine Immunität gegen eine Infektion mit KP-Virus vermag das gereinigte „lösliche Antigen“ beim Huhn nicht zu erzeugen.

Anreicherung und Reinigung eines löslichen Antigens aus Maul- und Klauenseuche-infizierten Hühnerembryonen

Es wurden drei Verfahren ausgearbeitet, mit denen es gelingt, das in infizierten Hühnerembryonen enthaltene lösliche Antigen der Maul- und Klauenseuche, Typ O, weitgehend zu reinigen. Das gereinigte Antigen sedimentiert in der analytischen Ultrazentrifuge mit einer Konstanten von mindestens 5 S. Seine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit beträgt in 0,1-ionaler Kochsalzlösung bei pH 7,2 —6,0 · 10-5 cm2 Volt -1 sec-1. Der Nucleinsäuregehalt des Antigens ist nach UV-Absorptionsmessungen nicht größer als 6%. Serologisch läßt sich das Antigen, wenn es in hoher Konzentration vorliegt, nicht nur durch die Komplementbindungsreaktion, sondern auch durdi die Präzipitationsprobe nachweisen. Von den reinsten Antigenpräparaten reichen bereits Mengen mit 0,6 γ N aus, um die Hämolyse in der Komplementbindungsprobe eindeutig zu hemmen. Eine aus Antigenkonzentraten hergestellte Adsorbatvakzine schützt Meerschweinchen nicht gegen Infektion mit Standard O Virus.

Über die Isolierung und Charakterisierung des Virus der klassischen Geflügelpest

Das Virus der klassischen Geflügeli est wurde aus bebrüteten Hühnereiern isoliert, um seine Eigenschaften mit denen des früher dargestellten Virus der atypischen Geflügelpest zu vergleichen. Es besitzt in Kochsalzlösung eine Sedimentationskonstante von 685 S und ein Partikelgewicht von 400 · 106, in Wasser ist s20 = 275 und das Teilchengewicht etwa halb so groß. Es ist möglich, daß darüber hinaus in wäßriger Lösung auch noch kleinere aktive Viruspartikel mit s20 ~ 130 vorkommen. Die Identität der isolierten Substanz mit dem Virus wurde gesichert durch Bestimmung der Infektiosität, der hämagglutinierenden Wirkung, durch serologische Untersuchungen und die Übereinstimmung der biologisch bestimmten Sedimentationskonstante des Virus mit der optisch für das Protein beobachteten. Nach den Ergebnissen der Sedimentations- und Diffusionsmessungen weicht die Gestalt des Virus erheblich von der Kugelform ab, was auch durch Viskositätsmessungen bestätigt wird. Elektronenoptisch findet man in Wasser kontrastarme runde Scheiben, in Salzlösung dichtere, vorwiegend kugelförmig erscheinende Teilchen. Es wird daher angenommen, daß die hohe Reibungskonstante nicht durch eine Anisodiametrie, sondern durch eine lockere Struktur des Virus bedingt wird. Die chemische Analyse ergibt, daß das Virus neben Protein und Desoxyribonucleinsäure auch noch andere phosphorhaltige Verbindungen enthält. Die komplexe Zusammensetzung und die ausgeprägte Variabilität der Größe zeigen, daß es sich nicht um ein definiertes Proteinmolekül handelt. In seiner Größe und Gestalt ist das Virus der klassischen Geflügelpest verschieden von dem der atypischen Geflügelpest. Da auch die serologischen Versuche keine Anzeichen für eine Verwandtschaft ergeben, sind diese Krankheitserreger als zwei verschiedene Virusarten zu bezeichnen.