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e 1984 até hoje: como o ensaio do cometa se tornou o padrão ouro para avaliar danos genéticos
Desde que foi desenvolvido pela primeira vez por Östling e Johansson em 1984, o ensaio cometa (também conhecido como eletroforese em gel de célula única, SCGE) tornou-se gradualmente uma ferramenta importante para avaliar danos ao DNA. Essa técnica simples e sensível é usada principalmente para detectar danos ao DNA no nível de células eucarióticas individuais e tem sido amplamente utilizada em vários campos, incluindo avaliação de danos/reparos ao DNA, biomonitoramento e testes de genotoxicidade.
O ensaio do cometa envolve a suspensão de células em agarose de baixo ponto de fusão, a lisação das células em condições neutras ou alcalinas e a submissão das células lisadas suspensas à eletroforese. O método recebe esse nome devido ao padrão de cometa que o DNA forma ao passar por um gel eletroforético.
Processo básico do experimento cometa
1. Etapas de incorporação
Amostras de células retiradas de cultura celular in vitro ou de indivíduos testados in vivo são dispersas em células individuais e suspensas em agarose de baixo ponto de fusão derretida a 37°C. Essa suspensão única foi então espalhada em lâminas de microscópio e montada usando lamínulas de vidro. À medida que a lamínula é colocada na lâmina do microscópio, a agarose derretida se espalha para formar uma camada fina. Em seguida, a agarose foi congelada a 4°C e a lamínula foi removida, formando uma matriz de fibras de carboidratos que encapsulou as células.
2. Etapa de lise
Após a remoção da lamínula, a lâmina do microscópio é imersa em uma solução que lisa as células. Soluções de lise comumente usadas incluem solução salina altamente concentrada e um detergente como Triton X-100. A função desses componentes é destruir proteínas e membranas celulares, expor a estrutura do DNA e formar nucleossomos com DNA helicoidal.
3. Etapa de eletroforese
Após a lise, as lâminas são lavadas para remover quaisquer sais e então imersas em uma segunda solução - a solução de eletroforese. Quando um campo elétrico é aplicado, fragmentos de DNA carregados negativamente se movem em direção ao eletrodo positivo até serem purificados e marcados com uma coloração específica. Observada por microscopia de fluorescência, a diferença de intensidade da cauda do cometa em relação à sua cabeça reflete o número de quebras de DNA.
A estrutura geral se assemelha a um cometa, com sua cabeça redonda correspondendo ao DNA não danificado restante na cavidade, e a cauda representando a quantidade de DNA danificado. Quanto mais brilhante e longa for a cauda, maior será o grau de dano.
Aplicações do ensaio do cometa
O ensaio do cometa tem uma ampla gama de aplicações, incluindo testes de genotoxicidade, biomonitoramento humano e estudos de bioepidemiologia. Por exemplo, por meio do ensaio do cometa, os pesquisadores descobriram que, com a idade, os danos ao DNA em neurônios e astrócitos no cérebro do rato aumentaram significativamente, incluindo múltiplas formas de danos, como quebras de fita simples e quebras de fita dupla.
Detecção de fragmentação de DNA de esperma
O ensaio do cometa também pode ser usado para avaliar o grau de fragmentação do DNA em células espermáticas, um indicador que está intimamente relacionado ao resultado da fertilização in vitro. Quando o teste é realizado, um procedimento adicional é realizado para destruir os prototécios do esperma.
Vantagens e desafios do ensaio do cometa
A popularidade do ensaio do cometa foi aumentada por sua simplicidade e baixo custo, particularmente em cenários onde testes mais complexos não estão disponíveis. Entretanto, a sensibilidade dessa técnica também a torna suscetível a fatores externos, levando a problemas com a reprodutibilidade dos resultados. Portanto, os pesquisadores precisam ser cautelosos e evitar qualquer interferência que possa causar danos ou desnaturação do DNA.
"O ensaio do cometa é uma ferramenta altamente sensível para avaliar danos ao DNA, mas seu uso eficaz depende de amplo conhecimento de base e técnicas."
Direções futuras da pesquisa
À medida que a biotecnologia avança, é inevitável que a tecnologia e as aplicações do ensaio cometa evoluam junto. Os pesquisadores estão explorando como melhorar ainda mais a precisão e a sensibilidade do teste e expandir sua aplicação em diferentes organismos e condições ambientais. Portanto, o futuro do ensaio cometa está cheio de desafios e oportunidades.
O uso dessa tecnologia na avaliação de danos genéticos, na ciência ambiental e na pesquisa médica, sem dúvida, continuará a crescer, junto com uma maior compreensão de seu uso adequado e interpretação dos resultados. Ao olharmos para o futuro, devemos pensar em como garantir que essa importante tecnologia possa atingir seu maior potencial na melhoria da saúde humana e na proteção do meio ambiente.
