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Segredos do teste do cometa: como detectar danos no DNA com técnicas simples?
Com o avanço da tecnologia genética, o estudo dos danos ao DNA tornou-se cada vez mais importante. Nesta área, uma tecnologia chamada teste de eletroforese em gel unicelular (também conhecida como ensaio do cometa) está gradualmente ganhando atenção. Esta é uma técnica simples e sensível capaz de detectar danos no DNA ao nível de células eucarióticas individuais. Esta técnica foi desenvolvida pela primeira vez por Östling e Johansson em 1984 e refinada em 1988 por Singh et al. Até à data, tornou-se uma das técnicas padrão para avaliação de danos/reparação do ADN e testes de genotoxicidade.
O ensaio do cometa recebe esse nome devido ao padrão de migração do DNA em seu gel de eletroforese, que muitas vezes se assemelha a um cometa.
O procedimento básico do ensaio cometa envolve a incorporação de células em agarose de baixo ponto de fusão, a seguir a lise das células sob condições neutras ou alcalinas e a realização de eletroforese. Após a eletroforese, o DNA danificado assume diferentes formas, com a intensidade relativa entre a cauda e a cabeça do cometa refletindo a extensão do dano ao DNA. A base desta técnica é que o ADN não danificado é altamente organizado em associação com proteínas da matriz no núcleo da célula e, quando o ADN é danificado, esta organização é perturbada, libertando estruturas de ADN não danificadas.
Etapas básicas do experimento com cometa
Células incorporadas
Primeiro, amostras de células obtidas de culturas celulares in vitro ou de indivíduos de teste in vivo são dispersas em células individuais e suspensas em agarose de baixo ponto de fusão a 37°C. Esta suspensão única é então aplicada a uma lâmina de microscópio e, quando a lamínula de vidro é abaixada, a agarose se expande e forma uma camada fina. Quando a agarose é congelada a 4°C, as células são imobilizadas dentro dela, formando uma matriz de agarose que estabiliza a posição das células.
Lise de células
Em seguida, as lâminas são embebidas numa solução de lise, que normalmente contém uma elevada concentração de sais solúveis em água e detergentes. Esses ingredientes destroem as proteínas dentro das células e destroem as membranas celulares, deixando o DNA intacto. As estruturas restantes do DNA são chamadas de nuclídeos e formam estruturas relativamente grandes e ordenadas.
Processo de eletroforese
Após o processo de lise, as lâminas são lavadas para retirada de todos os sais e imersas na solução de eletroforese. Neste momento, um campo elétrico específico é aplicado, e o DNA danificado será atraído pelo campo elétrico. Dependendo do comprimento do segmento da cadeia, a distância de migração será diferente, eventualmente formando uma estrutura de cauda e cabeça semelhante a um cometa.
A tecnologia de análise de imagem quantifica a intensidade geral de fluorescência dos nuclídeos, bem como a fluorescência do DNA em migração, permitindo avaliar a extensão dos danos ao DNA.
Escopo da Aplicação
O teste do cometa tem uma ampla gama de aplicações, incluindo testes de genotoxicidade, biomonitoramento humano, epidemiologia molecular e toxicologia genética ecológica. Pode não só ajudar os cientistas a compreender o impacto de diferentes factores ambientais no ADN, mas também aprofundar a nossa compreensão do processo de envelhecimento, rastreando os danos no ADN durante o envelhecimento.
Por exemplo, Swain e Rao relataram em seu estudo que o ensaio cometa mostrou um aumento significativo nos danos ao DNA em neurônios cerebrais e astrócitos em ratos idosos.
Aplicação na infertilidade masculina
Além disso, o teste do cometa também tem importante valor de aplicação no diagnóstico de infertilidade masculina. Esta tecnologia de teste pode ajudar a avaliar o grau de fragmentação do DNA no esperma e fornecer previsões de possíveis resultados durante a fertilização in vitro.
Desafios Experimentais
Embora o ensaio cometa seja um método muito sensível para detectar danos no DNA, a sua sensibilidade também o torna particularmente sensível a algumas alterações físicas que podem afectar a reprodutibilidade dos resultados. Portanto, cuidados especiais devem ser tomados ao realizar o procedimento para evitar quaisquer fatores interferentes que possam causar danos ao DNA.
Por ser uma tecnologia simples e econômica, o teste do cometa é frequentemente utilizado em ambientes de pesquisa com condições complexas e recursos financeiros limitados. Com o surgimento de mais pesquisas e ferramentas aprimoradas, as perspectivas de aplicação desta tecnologia são promissoras. Será que ela conseguirá romper mais gargalos científicos e descobrir novas formas de reparo do DNA no futuro?
