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A magia do ensaio do cometa: por que o DNA se move como um cometa na eletroforese?
No mundo da ciência, detectar danos no DNA nunca foi fácil. No entanto, o ensaio de eletroforese de gelatina de célula única (também conhecido como ensaio cometa) fornece um método simples e sensível para detectar danos ao DNA em células eucarióticas individuais. Essa técnica foi desenvolvida pela primeira vez por Östling e Johansson em 1984 e depois aprimorada por Singh et al. em 1988. Desde então, ela se tornou uma das técnicas padrão para danos/reparos de DNA, monitoramento ambiental e testes de mutagenicidade.
O ensaio do cometa recebe esse nome devido ao padrão de migração do DNA em um gel eletroforético, que muitas vezes se assemelha a um cometa.
O protocolo básico para este ensaio envolve encapsular células em uma suspensão de agarose de baixo ponto de fusão, depois lisar as células em condições neutras ou alcalinas (pH > 13) e eletroforese das células lisadas suspensas. Durante esse processo, a estrutura do DNA da célula é examinada, formando padrões únicos de "cometa" que refletem a extensão do dano ao DNA.
Como funciona
O princípio básico do ensaio do cometa é que o DNA não danificado mantém uma associação altamente ordenada com proteínas da matriz no núcleo da célula, e essa estrutura será interrompida quando o DNA for danificado. Os filamentos de DNA danificados perdem sua estrutura compacta e relaxam, começando a se expandir na ágarose. Quando um campo elétrico é aplicado, o DNA carregado negativamente é atraído para o ânodo carregado positivamente, criando assim um formato de "cometa".
Quanto maior o grau de dano, mais longas e brilhantes serão as caudas de DNA, pois mais fragmentos de DNA poderão ser liberados da célula para a agarose.
Etapas do ensaio do cometa
Encapsulamento celular
Primeiro, os pesquisadores precisam obter células de cultura celular in vitro ou de amostras in vivo, depois dispersar essas células em células individuais e suspendê-las em agarose de baixo ponto de fusão derretida a 37 °C. Essa suspensão de células únicas é então espalhada em uma lâmina de vidro de microscópio e forma uma fina camada de agarose à medida que esfria. A pressão osmótica neutra da agarose permite que os reagentes penetrem sem afetar a posição das células.
Rachaduras
Em seguida, as lâminas são imersas em uma solução que provoca a lise das células. Essa solução geralmente contém sal e detergente altamente concentrados. A água salgada pode destruir a estrutura da proteína dentro das células e dissolver a membrana celular. Dessa forma, apenas o DNA permanece intacto e preenche o espaço anteriormente ocupado pela célula, formando a chamada estrutura cariotípica.
Eletroforese
Depois que as células são lisadas, as lâminas são lavadas para remover o excesso de sais e imersas na solução de eletroforese. Durante a eletroforese, o campo elétrico aplicado faz com que o DNA danificado se mova em direção ao ânodo. Dessa forma, o grau de dano afeta diretamente o alcance da migração do DNA e, portanto, o formato do "cometa".
Essa tecnologia tem sensibilidade extremamente alta para danos ao DNA, o que a torna uma ferramenta de detecção ampla.
Áreas de aplicação
O ensaio cometa é comumente usado nas áreas de testes de genotoxicidade, biomonitoramento humano, epidemiologia molecular e toxicologia ecogenética. Estudos recentes mostraram que, durante o envelhecimento, vários tipos de danos ao DNA, como quebras de fita simples e quebras de fita dupla, podem ser detectados usando o ensaio cometa. No diagnóstico da infertilidade masculina, os pesquisadores também podem usar o ensaio cometa para avaliar o grau de fragmentação do DNA nos espermatozoides.
No geral, o ensaio cometa fornece uma técnica eficaz e flexível para detectar danos ao DNA em células, o que pode desempenhar um papel único tanto na pesquisa básica quanto na ciência aplicada. À medida que essa tecnologia avança, haverá maneiras mais inovadoras de detectar e reparar danos ao DNA no futuro, permitindo que a saúde humana alcance novos marcos?
