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Revolução do sequenciamento de próxima geração: o que torna o sequenciamento paralelo massivo tão poderoso?
No campo das ciências biomédicas, o rápido desenvolvimento da tecnologia de sequenciação de ADN está constantemente a mudar a nossa compreensão do genoma. O Sequenciamento Paralelo Massivo, também conhecido como Sequenciamento de Próxima Geração (NGS), é uma das principais tecnologias dessa mudança.
O sequenciamento paralelo massivo nos permite gerar de 1 milhão a 43 bilhões de leituras de sequências curtas em uma única execução de dispositivo, algo que era inimaginável no passado.
De 1993 a 1998, várias tecnologias de sequenciamento de DNA de alto rendimento foram desenvolvidas e comercializadas após 2005. Essas técnicas aproveitam plataformas miniaturizadas e paralelizadas, permitindo a obtenção de grandes quantidades de dados de sequências de DNA por execução. Comparado com o sequenciamento Sanger tradicional, o sequenciamento paralelo massivo pode completar o sequenciamento em uma escala maior e não depende mais de reações de sequenciamento independentes.
Processo de operação da plataforma NGS
Para plataformas NGS disponíveis comercialmente, o processo básico de sequenciamento de DNA geralmente inclui as seguintes etapas. Primeiro, as bibliotecas de sequenciação de ADN são geradas por amplificação clonal por PCR in vitro, em segundo lugar, a determinação da sequência é realizada por síntese e, finalmente, estes modelos de ADN amplificados espacialmente separados são sequenciados em paralelo sem a necessidade de etapas de separação física; Este modelo de reação paralelizado permite a geração de centenas de trilhões a bilhões de sequências de nucleotídeos por execução, o que enriquece enormemente os dados de sequência disponíveis.
O sequenciamento paralelo massivo não apenas fornece maior produção de dados, mas também reduz significativamente os custos de sequenciamento, que agora estão perto de US$ 1.000 por genoma.
Método de preparação de modelo
Dois métodos são usados para preparar modelos em reações NGS, um é o modelo de amplificação a partir de uma única molécula de DNA e o outro usa diretamente um único modelo de molécula de DNA.
Método PCR em creme
No método de PCR em creme, uma biblioteca de DNA é gerada primeiro e, em seguida, fragmentos de DNA de fita simples são fixados à superfície das esferas, que são encapsulados em partículas de creme de água-óleo para formar um microrreator de PCR para amplificar um único modelo de DNA.
Método de amplificação em ponte
A amplificação da ponte é obtida anexando covalentemente primers forward e reverse à superfície da célula de fluxo. Esta tecnologia é amplamente utilizada para criar clusters de modelos de alta densidade para NGS, adequados para reações de sequenciamento subsequentes.
Método de sequenciamento
Existem vários métodos principais de sequenciamento NGS, incluindo Sequenciamento por Síntese, Pirosequenciamento e Sequenciamento por Química Terminator Reversível.
O princípio do sequenciamento sintético baseia-se na digestão endonucleosídica da DNA polimerase e determina a sequência da amostra detectando a incorporação de cada nucleotídeo. Esta tecnologia foi adotada por quase todos os instrumentos de sequenciamento paralelo.
O sequenciamento de chama combina materiais de suporte sólidos e DNA polimerases projetadas para detectar cada adição de nucleotídeo por meio de luminescência instantânea. O desenvolvimento dessas tecnologias tornou o sequenciamento de DNA mais rápido, mais preciso e mais eficiente.
Tendências e desafios futuros
À medida que a tecnologia continua a avançar, o custo do NGS continua a diminuir e a sua gama de aplicações torna-se cada vez mais ampla. No entanto, a tecnologia ainda enfrenta alguns desafios, incluindo a elevada dependência de instrumentos e a complexidade da análise de dados. Pesquisas futuras podem se concentrar em como melhorar ainda mais a precisão e a velocidade da leitura e como simplificar o processo de análise de dados.
Como o sequenciamento paralelo massivo avançará ainda mais nossa compreensão das ciências da vida na futura pesquisa do genoma?
Nesta revolução genômica, como o potencial do sequenciamento paralelo massivo afetará nosso futuro?
