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O passado do sequenciamento de Sanger e o futuro dos NGs: como o sequenciamento de DNA passa de um único para paralelo?
No campo da ciência biomédica, a tecnologia de sequenciamento de DNA passou por mudanças significativas.Desde a introdução do sequenciamento de Sanger, o mistério do genoma foi revelado para nós e o surgimento do sequenciamento de próxima geração (NGS) levou essa tecnologia a novos patamares.Esse salto tecnológico de um único para o paralelo não apenas aumenta a velocidade do sequenciamento, mas também reduz o custo do sequenciamento, mudando assim o cenário da pesquisa da genômica.
O surgimento de NGS nos permite obter dezenas de milhões de dados genômicos em um curto período de tempo, o que é incomparável para o sequenciamento de Sanger.
NGS refere-se a vários métodos de sequenciamento de DNA de alto rendimento que utilizam o conceito de processamento paralelo em larga escala.Muitas dessas tecnologias surgiram uma após a outra de 1993 a 1998 e foram comercializadas em 2005.Essas tecnologias permitem que cada instrumento gere de 1 milhão a 43 bilhões de lê sequência curta quando executado.Nessas plataformas, as configurações técnicas e a química de sequenciamento diferem, mas compartilham um paradigma técnico comum: sequenciamento paralelo em larga escala através de modelos de DNA amplificados clonalmente espacialmente isolados ou moléculas de DNA único.
Ao mesmo tempo, o sequenciamento de Sanger também é conhecido como sequenciamento de primeira geração, que depende da eletroforese para separar os produtos finais.Embora esse método tenha uma longa história, parece sem escrúpulos quando enfrentando as necessidades científicas atuais.A metodologia NGS nos permite concluir o trabalho de sequenciamento em larga escala ao mesmo tempo, trazendo eficiência e precisão sem precedentes à pesquisa genética.
Plataforma NGS
O processo de seqüenciamento de DNA usando plataformas NGS disponíveis comercialmente é geralmente dividido em várias etapas:
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As bibliotecas de sequenciamento de DNA foram geradas por amplificação clonal de PCR in vitro.
- A sequência de DNA é determinada pelo sequenciamento sintético com base no aumento de nucleotídeos na fita complementar.
- Os modelos de DNA amplificados espacialmente isolados são sequenciados simultaneamente de maneira paralela em larga escala, sem a necessidade de etapas de separação física.
Embora essas etapas sejam semelhantes na maioria das plataformas NGS, as estratégias de cada plataforma variam, o que torna cada tecnologia exclusiva e de aplicativos no mercado.
A reação de sequenciamento paralela dos NGs pode gerar centenas de mega a gigabit nucleotídeo sequência lida em uma única execução de instrumento.Essa mudança aumentou bastante a quantidade de dados de sequência disponíveis, resultando em mudanças fundamentais nos métodos de sequenciamento do genoma da ciência médica.Com o surgimento de tecnologias e instrumentos emergentes do NGS, o custo do sequenciamento também foi significativamente reduzido, aproximando -se do padrão de apenas US $ 1.000 por genoma.
Método de preparação de modelosAo realizar reações de NGS, existem dois métodos principais para preparar modelos: modelos de amplificação de uma única molécula de DNA e um único modelo de molécula de DNA.
Para sistemas de imagem que não podem detectar um único evento fluorescente, o modelo de DNA precisa ser amplificado.Os métodos de amplificação comum incluem PCR emulsão, amplificação do anel rolante e amplificação de fase sólida.
loção PCR
No método de PCR emulsão, uma biblioteca de DNA é gerada pela fragmentação aleatória do DNA genômico e, em seguida, o fragmento de DNA de fita simples é conectada à superfície da partícula com o ligante. representa um fragmento de DNA.As partículas são então embaladas em gotículas de emulsão de óleo de água, cada uma das quais é um micro-reator de PCR, onde é produzida uma cópia de modelo de DNA único amplificado.
Amplificação da ponte
Na amplificação da ponte, os iniciadores avançados e reversos são conectados covalentemente ao substrato da célula de fluxo em alta densidade.Depois que o reagente enzimaticamente estendido é exposto, o modelo emparelhado se estende por cima dos iniciadores de superfície, concluindo finalmente a amplificação local de polímeros de DNA em milhões de locais diferentes, tornando -se um cluster de modelo independente.
modelo molecular único
A preparação de modelos de molécula única é mais intuitiva em comparação, o que não requer uma etapa de PCR.Geralmente, os modelos moleculares únicos são fixados no suporte sólido e amplificados de maneiras diferentes.Como na primeira abordagem, os iniciadores espacialmente distribuídos são imobilizados no suporte sólido, e os fragmentos de DNA clivados aleatoriamente são então hibridados com os iniciadores imobilizados.
Método de seqüenciamentoOs métodos de seqüenciamento de NGs têm suas próprias características, incluindo sequenciamento sintético, pirosequenciação e química reversível do Terminator.O objetivo do sequenciamento sintético é determinar a sequência da amostra detectando a adição de nucleotídeos da DNA polimerase.
Indiscutivelmente, depois de perder as etapas tediosas necessárias para o seqüenciamento tradicional de Sanger, o NGS fornece um paradigma mais eficiente para a pesquisa genômica.
À medida que a tecnologia se desenvolve, testemunhamos a transição do sequenciamento de DNA de um método de sequência única precoce para o modelo de processamento paralelo de hoje, o que não apenas melhora bastante a eficiência, mas também traz vantagens sem precedentes em custo e tempo.Em que direção a futura tecnologia de sequenciamento de DNA se desenvolverá?
