<р>
В области биомедицинских наук быстрое развитие технологии секвенирования ДНК постоянно меняет наше понимание генома. Массивное параллельное секвенирование, также известное как секвенирование следующего поколения (NGS), является одной из основных технологий этого изменения.
Массовое параллельное секвенирование позволяет нам генерировать от 1 до 43 миллиардов считываний коротких последовательностей за один запуск устройства, что раньше было невообразимо.
<р>
С 1993 по 1998 год было разработано и коммерциализировано несколько технологий высокопроизводительного секвенирования ДНК, после 2005 года. В этих методах используются преимущества миниатюрных и параллельных платформ, что позволяет получать большие объемы данных о последовательностях ДНК за один цикл. По сравнению с традиционным секвенированием по Сэнгеру, массовое параллельное секвенирование позволяет выполнять секвенирование в более крупных масштабах и больше не зависит от независимых реакций секвенирования.
Процесс работы платформы NGS
<р>
Для коммерчески доступных платформ NGS базовый процесс секвенирования ДНК обычно включает следующие этапы. Во-первых, библиотеки секвенирования ДНК создаются путем клональной амплификации с помощью ПЦР in vitro; во-вторых, определение последовательности осуществляется путем синтеза и, наконец, эти пространственно разделенные амплифицированные матрицы ДНК секвенируются параллельно без необходимости физического разделения; Эта модель параллельных реакций позволяет генерировать от сотен триллионов до миллиардов нуклеотидных последовательностей за один цикл, что значительно обогащает доступные данные о последовательностях.
Массовое параллельное секвенирование не только обеспечивает более высокую производительность данных, но и значительно снижает затраты на секвенирование, которые сейчас приближаются к 1000 долларов США за геном.
Метод подготовки шаблона
<р>
Для приготовления матриц в реакциях NGS используются два метода: один — матрица амплификации из одной молекулы ДНК, а другой — непосредственное использование матрицы из одной молекулы ДНК.
Метод ПЦР крема
<р>
В методе ПЦР крема сначала создается библиотека ДНК, а затем к поверхности шариков прикрепляются одноцепочечные фрагменты ДНК, которые инкапсулируются в частицы водно-масляного крема, образуя микрореактор ПЦР для амплификации одной матрицы ДНК.
Мостовой метод усиления
<р>
Мостиковая амплификация достигается путем ковалентного прикрепления прямого и обратного праймеров к поверхности проточной кюветы. Эта технология широко используется для создания матричных кластеров высокой плотности для NGS, пригодных для последующих реакций секвенирования.
Метод секвенирования
<р>
Существует несколько основных методов секвенирования NGS, включая секвенирование путем синтеза, пиросеквенирование и секвенирование с помощью обратимой химии терминаторов.
Принцип синтетического секвенирования основан на эндонуклеозидном расщеплении ДНК-полимеразы и определяет последовательность образца путем обнаружения включения каждого нуклеотида. Эта технология используется почти во всех инструментах параллельного секвенирования.
<р>
Пламенное секвенирование сочетает в себе твердые материалы-подложки и сконструированные ДНК-полимеразы для обнаружения каждого добавления нуклеотидов посредством мгновенной люминесценции. Развитие этих технологий сделало секвенирование ДНК более быстрым, точным и эффективным.
Будущие тенденции и проблемы
<р>
Поскольку технология продолжает развиваться, стоимость NGS продолжает снижаться, а диапазон ее применения становится все шире и шире. Однако технология по-прежнему сталкивается с некоторыми проблемами, включая высокую зависимость от инструментов и сложность анализа данных. Будущие исследования могут быть сосредоточены на том, как еще больше повысить точность и скорость чтения, а также как упростить процесс анализа данных.
Как массовое параллельное секвенирование продвинет наше понимание наук о жизни в будущих исследованиях генома?
Как в этой революции в геномике потенциал массового параллельного секвенирования повлияет на наше будущее?