Language
Country/Area
No result found
Прошлое секвенирование Sanger и будущее NGS: как секвенирование ДНК идет от одиночной к параллельной?
В области биомедицинской науки технология секвенирования ДНК претерпела значительные изменения.С момента введения секвенирования Sanger загадка генома была представлена для нас, и появление секвенирования следующего поколения (NGS) подтолкнуло эту технологию к новым высотам.Этот технологический скачок от одиночного до параллельности не только увеличивает скорость секвенирования, но и снижает стоимость секвенирования, тем самым изменяя исследовательский ландшафт геномики.
Появление NGS позволяет нам получать десятки миллионов геномных данных за короткий период времени, что несравнено с секвенированием Sanger.
NGS относится к различным высокопроизводительным методам секвенирования ДНК, которые используют концепцию крупномасштабной параллельной обработки.Многие из этих технологий появились один за другим с 1993 по 1998 год и были коммерциализированы в 2005 году.Эти технологии позволяют каждому инструменту генерировать от 1 миллиона до 43 миллиардов коротких последовательностей при запуске.На этих платформах технические конфигурации и химия секвенирования различаются, но они имеют общую техническую парадигму: крупномасштабное параллельное секвенирование посредством пространственно изолированных, клонально амплифицированных матриц ДНК или молекул отдельных ДНК.
В то же время секвенирование Sanger также называется секвенированием первого поколения, которое опирается на электрофорез для разделения конечных продуктов.Хотя этот метод имеет долгую историю, он кажется недобросовестным, когда сталкивается с текущими научными потребностями.Методология NGS позволяет нам выполнять крупномасштабную работу секвенирования одновременно, обеспечивая беспрецедентную эффективность и точность в генетических исследованиях.
ngs platform
Процесс секвенирования ДНК с использованием коммерчески доступных платформ NGS обычно делится на несколько этапов:
- Библиотеки секвенирования ДНК были получены путем клональной амплификации PCR in vitro.
- Последовательность ДНК определяется синтетическим секвенированием на основе увеличения нуклеотидов на дополнительной цепи.
- Пространственно изолированные, амплифицированные матрицы ДНК секвенируют одновременно в широкомасштабном параллельном виде без необходимости физического разделения.
Хотя эти шаги одинаковы на большинстве платформ NGS, стратегии каждой платформы различаются, что делает каждую технологию уникальной и областями применения на рынке.
Параллелизированная реакция секвенирования NGS может генерировать сотни считывает сотни считывающихся последовательности нуклеотидов в одном приборе.Это изменение значительно увеличило объем доступных данных о последовательности, что приводит к фундаментальным изменениям в методах секвенирования генома медицинской науки.С появлением новых технологий и инструментов NGS стоимость секвенирования также была значительно снижена, приближаясь к стандарту всего 1000 долларов США за геном.
Метод подготовки шаблона
При выполнении реакций NGS существует два основных метода для приготовления шаблонов: шаблоны амплификации из одной молекулы ДНК и одного шаблона молекулы ДНК.
Для систем визуализации, которые не могут обнаружить единое флуоресцентное событие, матрицу ДНК необходимо усилить.Обычные методы амплификации включают эмульсионную ПЦР, амплификацию каллингового кольца и амплификацию твердой фазы.
лосьон ПЦР
В методе ПЦР Эмульсии библиотека ДНК сначала генерируется случайной фрагментацией геномной ДНК, а затем одноцепочечный фрагмент ДНК подключен к поверхности частицы с помощью линкер. представляет фрагмент ДНК.Затем частицы упаковываются в капли эмульсии с водой-масло, каждая из которых представляет собой микрореактор ПЦР, где образуется амплифицированная матричная копия отдельной ДНК.
мостовое усиление
При амплификации моста вперед и обратные праймеры ковалентно прикреплены к субстрату проточной ячейки при высокой плотности.После того, как ферментатически расширенный реагент обнажается, парный шаблон простирается над поверхностными праймерами, в конечном итоге завершая локальную амплификацию ДНК -полимеров в миллионах различных мест, став независимым кластером шаблонов.
одномолекулярный шаблон
Подготовка шаблонов с одной молекулярной, более интуитивно понятной, что не требует шага ПЦР.Как правило, одномолекулярные шаблоны фиксируются на твердой поддержке и усиливаются по-разному.Как и в первом подходе, пространственно распределенные праймеры иммобилизованы на твердой поддержке, а случайно расщепленные фрагменты ДНК затем гибридизуются с иммобилизованными праймерами.
Метод секвенирования
Методы секвенирования NGS имеют свои собственные характеристики, включая синтетическое секвенирование, пиросеквенирование и обратимую химию терминатора.Цель синтетического секвенирования состоит в том, чтобы определить последовательность образца путем обнаружения добавления нуклеотидов ДНК -полимеразы.
Возможно, после потери утомительных шагов, необходимых для традиционного секвенирования Sanger, NGS обеспечивает более эффективную парадигму для геномных исследований.
По мере развития технологии мы стали свидетелями перехода секвенирования ДНК от раннего метода единой последовательности к сегодняшней модели параллельной обработки, которая не только значительно повышает эффективность, но и приносит беспрецедентные преимущества в стоимости и времени.В каком направлении будет развиваться будущая технология секвенирования ДНК?
