Language
Country/Area
No result found
Удивительное сочетание антитела и антигена: как работает иммуногистохимия?
Иммуногистохимия (ИГХ) — это метод, основанный на связывании антител со специфическими антигенами, с помощью которого можно подтвердить присутствие антигенов в клетках и тканях. Этот метод возник на основе технологии иммунофлуоресценции, разработанной такими учеными, как Альберт Хьюитт Кунс, в 1941 году, которая заложила основу для последующей иммуногистохимии. Со временем иммуногистохимия стала широко использоваться в диагностике рака, особенно при выявлении опухолевых антигенов. Поэтому понимание процедур иммуногистохимии имеет решающее значение для медицинских и биологических исследований.
В настоящее время иммуногистохимия рассматривается как мощный инструмент исследования биомаркеров. С помощью этой технологии исследователи могут определять экспрессию и локализацию различных белков в биологических тканях.
Подготовка проб
Иммуногистохимия проводится с использованием образцов тканей, которые фиксируются и заливаются парафином, иногда также используются криоконсервированные (замороженные) ткани. Процесс подготовки образца включает фиксацию, извлечение антигена, инкубацию с первичными антителами и, наконец, инкубацию со вторичными антителами. На протяжении всего этого процесса каждый шаг имеет решающее значение для конечного результата.
Подготовка и фиксация тканей
Перед выполнением иммуногистохимии ткань фиксируют для сохранения морфологической структуры ткани. Для фиксации обычно используется 10% нейтральный забуференный формалин. Время фиксации и соотношение реагентов существенно влияют на результаты эксперимента. Вообще говоря, время фиксации составляет 24 часа, а соотношение фиксатора к ткани колеблется от 1:1 до 1:20.
Фрагмент
Срезы образцов проводили с помощью микротома. Ткани, залитые парафином, обычно делают срезы толщиной 4 микрона, а криосрезы — толщиной от 4 до 6 микронов. Толщина срезов является решающим фактором успеха иммуногистохимии, поскольку различия в толщине могут повлиять на наблюдаемую презентацию антигена.
Извлечение антигена
Извлечение антигена необходимо для большинства фиксированных срезов тканей. Его цель — восстановить поперечные связи, образовавшиеся при фиксации, чтобы сделать эпитоп доступным для антитела. Распространенным методом извлечения антигена является погружение срезов в буфер путем нагревания при высоких температурах.
Успешность обнаружения антигена часто определяет чувствительность и специфичность иммуногистохимического анализа.
Заблокировать
В иммуногистохимии неспецифическое связывание антител может вызвать проблемы с фоновым окрашиванием. Чтобы уменьшить фоновое окрашивание, образцы часто инкубируют с нормальной сывороткой того вида, из которого были получены вторичные антитела.
Пример тега
После завершения подготовки образца его можно пометить антителами, меченными флуоресцентными соединениями, металлами или ферментами. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, в зависимости от желаемого применения.
Метод обнаружения
В иммуногистохимии существует два основных метода обнаружения: прямой метод и непрямой метод. Прямой метод использует меченые антитела для прямой реакции с антигенами в срезах, тогда как непрямой метод используется для повышения чувствительности и увеличения эффекта усиления сигнала за счет комбинации вторичных антител.
Преимущество непрямого метода в том, что он требует генерации относительно небольшого количества меченых вторичных антител, что очень полезно при многократном мечении.
Репортер
Репортерные молекулы, используемые в различных методах обнаружения, различны, но наиболее распространенными являются хромогенное и флуоресцентное обнаружение. В иммуногистохимии хромогена антитела объединяются с ферментами и реагируют с субстратами, образуя видимый цвет. При обнаружении флуоресценции используются флуоресцентные пигменты, которые заставляют антитела светиться и облегчают наблюдение.
Окрашивание с обратным подсчетом
После завершения иммуногистохимического окрашивания часто применяется окрашивание с обратным счетом, чтобы обеспечить контраст и помочь направить и визуализировать ткань.
Во многих случаях окрашивание с обратным счетом может значительно улучшить наблюдательные возможности исследователя.
Устранение неполадок
При применении иммуногистохимии могут возникнуть такие проблемы, как чрезмерное фоновое окрашивание, слабое окрашивание целевого антигена и артефакты, которые повлияют на результаты теста. Поэтому необходимо оптимизировать методы иммуногистохимии и обеспечить качество антител.
Иммуногистохимические маркеры в клинической диагностике
Эта технология стала важным инструментом в нейробиологических исследованиях не только для подтверждения экспрессии белка, но и для идентификации опухолей. Например, маркеры CD15 и CD30 используются при болезни Ходжкина, а ПСА – для диагностики рака простаты.
Направленная терапия
По мере развития методов лечения рака иммуногистохимия может использоваться для оценки того, какие опухоли могут реагировать на лечение, путем обнаружения присутствия молекулярных мишеней. Гормональные рецепторы в некоторых опухолях можно подтвердить с помощью иммуногистохимических сигналов, что может помочь улучшить реализацию персонализированной терапии.
Поэтому иммуногистохимия является не только диагностическим инструментом, но и ключевым компонентом процесса клинического лечения.
Подводя итог, иммуногистохимия предоставляет нам мощный инструмент для идентификации и локализации биомаркеров на клеточном и тканевом уровнях. Однако как мы можем дополнительно оптимизировать эту технологию, чтобы лучше служить медицинским и исследовательским сообществам в будущем?
