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Dalla fissazione dei tessuti alla colorazione: conosci il misterioso processo dell'immunoistochimica?
L'immunoistochimica è una tecnica di immunocolorazione che si concentra sul riconoscimento selettivo degli antigeni (proteine) nelle cellule e nei tessuti da parte degli anticorpi. Questa tecnica si è evoluta dalla tecnica dell'immunofluorescenza sviluppata originariamente da Albert Hewitt Coons e altri nel 1941. Nel corso del tempo, l'immunoistochimica è diventata molto comune nella diagnosi del cancro e nella ricerca di base, aiutando gli scienziati a esplorare la distribuzione di biomarcatori e proteine differenzialmente espresse in diversi tessuti biologici.
Preparazione del campione
L'immunoistochimica può essere eseguita su tessuti fissati e inclusi in paraffina oppure su tessuti congelati. Prima del campionamento è necessario eseguire una serie di passaggi diversi, a seconda delle modalità di conservazione del tessuto. Le fasi generali includono: fissazione appropriata, recupero dell'antigene, incubazione con anticorpi primari e successiva incubazione con anticorpi secondari.
Preparazione e fissazione dei tessuti
La riparazione dei tessuti è fondamentale per preservarne la struttura e la forma cellulare. La formulazione del fissativo, il rapporto tra fissativo e tessuto e il tempo di fissazione influenzeranno significativamente i risultati finali. Di solito come fissativo si utilizza formalina neutra tamponata al 10% e il tempo di fissazione è solitamente di 24 ore a temperatura ambiente.
Fetta
I campioni di tessuto sono stati sezionati utilizzando un microtomo. Per i tessuti inclusi in paraffina, lo spessore standard è di 4 micron, mentre le sezioni congelate hanno in genere uno spessore compreso tra 4 e 6 micron. Lo spessore delle sezioni è fondamentale e spessori diversi possono influenzare la visualizzazione degli antigeni, pertanto è necessario prestare la massima cautela quando si esegue l'immunoistochimica.
Recupero dell'antigene
Nelle sezioni di tessuto fissate, il recupero dell'antigene rende i siti antigenici visibili agli anticorpi. Durante la fissazione possono formarsi ponti metanici o legami incrociati di gruppi amminici, ostacolando così il legame degli anticorpi. Il metodo più comune per il recupero dell'antigene è il recupero dell'antigenicità latente mediante riscaldamento e immersione in tampone.
Esempio di tag
L'etichettatura dei campioni può essere effettuata utilizzando anticorpi marcati con composti fluorescenti, metalli o enzimi per distinguere efficacemente gli antigeni bersaglio.
Metodi di rilevamento
Il metodo diretto è un metodo di colorazione in un unico passaggio, mentre il metodo indiretto prevede che un anticorpo primario non marcato si leghi prima all'antigene bersaglio, seguito dall'aggiunta di un anticorpo secondario che si lega all'anticorpo primario. Grazie all'effetto di amplificazione del segnale del metodo indiretto, esso presenta una maggiore sensibilità ed è ampiamente utilizzato nel rilevamento di più antigeni.
Molecole reporter di rilevamento
Le molecole reporter rilevate variano a seconda del metodo di rilevamento; le più comuni sono il cromogeno e la rilevazione fluorescente. Nell'immunoistochimica cromogenica, gli anticorpi sono solitamente coniugati a un enzima e producono un colore visibile in presenza di un substrato cromogenico. Nella rilevazione tramite immunofluorescenza, l'anticorpo viene marcato con un fluoroforo.
Applicazione nella pratica clinica
Le tecniche di immunoistochimica hanno svolto un ruolo fondamentale nella diagnosi patologica chirurgica, in particolare nell'immunofenotipizzazione dei tumori (ad esempio, nell'identificazione dei marcatori per il cancro al seno). Ha un'ampia gamma di applicazioni, tra cui la neuroscienza e la diagnostica dei tumori, aiutando i ricercatori a esplorare il comportamento delle proteine in tessuti specifici.
Affrontare la sfida
Nell'immunoistochimica ci sono diversi passaggi che possono portare a diversi problemi, come ad esempio una colorazione di fondo eccessiva o una marcatura insufficiente dell'antigene.
Per risolvere questi problemi, i ricercatori devono ottimizzare la qualità e la tecnologia degli anticorpi.
ConclusioneL'immunoistochimica non è solo una tecnica di rilevamento efficace, ma consente anche di scoprire e comprendere la distribuzione delle proteine nei tessuti biologici. Con il progresso della tecnologia, la sua applicazione in ambito clinico e di ricerca continuerà ad espandersi. Siete disposti a esplorare i nuovi orizzonti che questa tecnologia potrebbe aprire?
