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La meravigliosa combinazione di anticorpo e antigene: come funziona l'immunoistochimica?
L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica che si basa sul legame di anticorpi con antigeni specifici, attraverso la quale è possibile confermare la presenza di antigeni nelle cellule e nei tessuti. Questo metodo ha avuto origine dalla tecnologia dell'immunofluorescenza sviluppata da scienziati come Albert Hewett Coons nel 1941, che ha gettato le basi per la successiva immunoistochimica. Nel corso del tempo, l’immunoistochimica è stata ampiamente utilizzata nella diagnosi del cancro, in particolare nell’identificazione degli antigeni tumorali. Pertanto, comprendere le procedure dell'immunoistochimica è fondamentale per la ricerca medica e biologica.
Oggi l'immunoistochimica è considerata un potente strumento per l'esplorazione dei biomarcatori. Attraverso questa tecnologia, i ricercatori possono determinare l'espressione e la localizzazione di diverse proteine nei tessuti biologici.
Preparazione del campione
L'immunoistochimica viene eseguita utilizzando campioni di tessuto fissati e incorporati in paraffina e talvolta viene utilizzato anche tessuto crioconservato (congelato). Il processo di preparazione del campione comprende la fissazione, il recupero dell'antigene, l'incubazione con anticorpi primari e infine l'incubazione con anticorpi secondari. Durante questo processo, ogni passaggio è fondamentale per il risultato finale.
Preparazione e fissazione dei tessuti
Prima di eseguire l'immunoistochimica, il tessuto viene fissato per preservarne la struttura morfologica. Il reagente utilizzato per la fissazione è solitamente formalina tamponata neutra al 10%. Il tempo di fissazione e il rapporto dei reagenti influenzeranno in modo significativo i risultati sperimentali. In generale, il tempo di fissazione è di 24 ore e il rapporto tra fissativo e tessuto varia da 1:1 a 1:20.
Taglia
Il sezionamento dei campioni è stato eseguito utilizzando un microtomo. Il tessuto incluso in paraffina viene generalmente sezionato a uno spessore di 4 micron, mentre le criosezioni vengono sezionate a 4-6 micron. Lo spessore delle sezioni è un fattore critico per il successo dell'immunoistochimica, poiché le differenze di spessore possono influenzare la presentazione dell'antigene osservata.
Recupero dell'antigene
Il recupero dell'antigene è necessario per la maggior parte delle sezioni di tessuto fissate. Il suo scopo è ripristinare i legami incrociati formati durante la fissazione per rendere l'epitopo accessibile all'anticorpo. Un metodo comune per il recupero dell'antigene consiste nell'immergere le sezioni nel tampone riscaldandole ad alte temperature.
Il successo del recupero dell'antigene spesso determina la sensibilità e la specificità dei test immunoistochimici.
Blocca
In immunoistochimica, il legame non specifico degli anticorpi può causare problemi di colorazione di fondo. Per ridurre la colorazione di fondo, i campioni vengono spesso incubati con siero normale della specie da cui è stato prodotto l'anticorpo secondario.
Tag di esempio
Una volta completata la preparazione del campione, è possibile etichettarlo con anticorpi marcati con composti fluorescenti, metalli o enzimi. Gli anticorpi possono essere policlonali o monoclonali, a seconda dell'applicazione desiderata.
Metodo di rilevamento
Esistono due metodi di rilevamento principali in immunoistochimica: metodo diretto e metodo indiretto. Il metodo diretto utilizza anticorpi marcati per reagire direttamente con gli antigeni nelle sezioni, mentre il metodo indiretto viene utilizzato per migliorare la sensibilità e aumentare l'effetto di amplificazione del segnale attraverso la combinazione di anticorpi secondari.
Il vantaggio del metodo indiretto è che richiede la generazione di un numero relativamente piccolo di anticorpi secondari marcati, il che è molto utile in caso di etichettatura multipla.
Giornalista
Le molecole reporter utilizzate nei vari metodi di rilevamento sono diverse e quelle comuni sono il cromogeno e il rilevamento a fluorescenza. Nell'immunoistochimica del cromogeno, gli anticorpi vengono combinati con enzimi e reagiscono con i substrati per produrre un colore visibile. Il rilevamento della fluorescenza utilizza pigmenti fluorescenti per far brillare l'anticorpo per una facile osservazione.
Colorazione per conteggio inverso
Una volta completata la colorazione immunoistochimica, viene spesso applicata la colorazione con conteggio inverso per fornire contrasto e aiutare a guidare e visualizzare il tessuto.
In molti casi, la colorazione con conteggio inverso può migliorare significativamente le capacità di osservazione del ricercatore.
Risoluzione dei problemi
Nell'applicazione dell'immunoistochimica, possono verificarsi problemi quali un'eccessiva colorazione di fondo, una debole colorazione dell'antigene bersaglio e artefatti, che influenzeranno i risultati del test. Pertanto, le tecniche immunoistochimiche dovrebbero essere ottimizzate e la qualità degli anticorpi dovrebbe essere garantita.
Marcatori immunoistochimici nella diagnosi clinica
Questa tecnologia è diventata uno strumento importante nella ricerca neuroscientifica, non solo per confermare l'espressione delle proteine, ma anche per l'identificazione dei tumori. Ad esempio, i marcatori CD15 e CD30 vengono utilizzati per la malattia di Hodgkin, mentre il PSA viene utilizzato per la diagnosi del cancro alla prostata.
Terapia guidata
Con l'avanzamento dei trattamenti antitumorali, l'immunoistochimica può essere utilizzata per valutare quali tumori potrebbero rispondere al trattamento rilevando la presenza di bersagli molecolari. I recettori ormonali in alcuni tumori possono essere confermati da segnali immunoistochimici, che possono aiutare a migliorare l’implementazione della terapia personalizzata.
Pertanto, l'immunoistochimica non è solo uno strumento diagnostico ma anche una componente chiave nel processo di trattamento clinico.
In sintesi, l'immunoistochimica ci fornisce un potente strumento per identificare e localizzare i biomarcatori a livello cellulare e tissutale. Tuttavia, come possiamo ottimizzare ulteriormente questa tecnologia per servire meglio le comunità mediche e di ricerca in futuro?
