Claire Fenech

Ric-8A, a Gα Protein Guanine Nucleotide Exchange Factor Potentiates Taste Receptor Signaling

Taste receptors for sweet, bitter and umami tastants are G-protein-coupled receptors (GPCRs). While much effort has been devoted to understanding G-protein-receptor interactions and identifying the components of the signalling cascade downstream of these receptors, at the level of the G-protein the modulation of receptor signal transduction remains relatively unexplored. In this regard a taste-specific regulator of G-protein signaling (RGS), RGS21, has recently been identified. To study whether guanine nucleotide exchange factors (GEFs) are involved in the transduction of the signal downstream of the taste GPCRs we investigated the expression of Ric-8A and Ric-8B in mouse taste cells and their interaction with G-protein subunits found in taste buds. Mammalian Ric-8 proteins were initially identified as potent GEFs for a range of Gα subunits and Ric-8B has recently been shown to amplify olfactory signal transduction. We find that both Ric-8A and Ric-8B are expressed in a large portion of taste bud cells and that most of these cells contain IP3R-3 a marker for sweet, umami and bitter taste receptor cells. Ric-8A interacts with Gα-gustducin and Gαi2 through which it amplifies the signal transduction of hTas2R16, a receptor for bitter compounds. Overall, these findings are consistent with a role for Ric-8 in mammalian taste signal transduction.

Specific expression of olfactory binding protein in the aerial olfactory cavity of adult and developing Xenopus

Olfactory binding proteins (OBP), commonly associated with aerial olfaction, are found in the olfactory mucus of mammals but have never been identified in fish. It is still not clear whether the presence of OBP in aerial olfactory systems is due to phylogenetic or to functional differences linked to the adaptation of the olfactory system to an aerial environment. To test this alternative, the olfactory system of Xenopus offers a unique opportunity because it includes two olfactory cavities, one of which is thought to be devoted to aquatic olfaction and the other to aerial olfaction. We therefore purified and cloned OBPs in two Xenopus species. Xenopus laevis OBP (XlaeOBP) and Xenopus tropicalis OBP (XtroOBP) exhibit 158 and 160 amino acids, respectively, sharing 89 residues. cRNA probes allowed us to demonstrate that XlaeOBP and XtroOBP are expressed at the level of Bowmans gland specifically in the aerial olfactory cavity, as confirmed using anti‐XlaeOBP antiserum. OBP mRNA transcription occurs early during metamorphosis, as early as stageu200357. This is the first study to demonstrate that OBPs are exclusively present in the aerial chamber and are only expressed as the tadpole becomes an adult in species which possess both aquatic and aerial olfactory organs.

Transient Receptor Potential Canonical 3 (TRPC3) Channels Are Required for Hypothalamic Glucose Detection and Energy Homeostasis

The mediobasal hypothalamus (MBH) contains neurons capable of directly detecting metabolic signals such as glucose to control energy homeostasis. Among them, glucose-excited (GE) neurons increase their electrical activity when glucose rises. In view of previous work, we hypothesized that transient receptor potential canonical type 3 (TRPC3) channels are involved in hypothalamic glucose detection and the control of energy homeostasis. To investigate the role of TRPC3, we used constitutive and conditional TRPC3-deficient mouse models. Hypothalamic glucose detection was studied in vivo by measuring food intake and insulin secretion in response to increased brain glucose level. The role of TRPC3 in GE neuron response to glucose was studied by using in vitro calcium imaging on freshly dissociated MBH neurons. We found that whole-body and MBH TRPC3-deficient mice have increased body weight and food intake. The anorectic effect of intracerebroventricular glucose and the insulin secretory response to intracarotid glucose injection are blunted in TRPC3-deficient mice. TRPC3 loss of function or pharmacological inhibition blunts calcium responses to glucose in MBH neurons in vitro. Together, the results demonstrate that TRPC3 channels are required for the response to glucose of MBH GE neurons and the central effect of glucose on insulin secretion and food intake.

Identification of new binding partners of the chemosensory signaling protein Gγ13 expressed in taste and olfactory sensory cells.

Tastant detection in the oral cavity involves selective receptors localized at the apical extremity of a subset of specialized taste bud cells called taste receptor cells (TRCs). The identification of the genes coding for the taste receptors involved in this process have greatly improved our understanding of the molecular mechanisms underlying detection. However, how these receptors signal in TRCs, and whether the components of the signaling cascades interact with each other or are organized in complexes is mostly unexplored. Here we report on the identification of three new binding partners for the mouse G protein gamma 13 subunit (Gγ13), a component of the bitter taste receptors signaling cascade. For two of these Gγ13 associated proteins, namely GOPC and MPDZ, we describe the expression in taste bud cells for the first time. Furthermore, we demonstrate by means of a yeast two-hybrid interaction assay that the C terminal PDZ binding motif of Gγ13 interacts with selected PDZ domains in these proteins. In the case of the PDZ domain-containing protein zona occludens-1 (ZO-1), a major component of the tight junction defining the boundary between the apical and baso-lateral region of TRCs, we identified the first PDZ domain as the site of strong interaction with Gγ13. This association was further confirmed by co-immunoprecipitation experiments in HEK 293 cells. In addition, we present immunohistological data supporting partial co-localization of GOPC, MPDZ, or ZO-1, and Gγ13 in taste buds cells. Finally, we extend this observation to olfactory sensory neurons (OSNs), another type of chemosensory cells known to express both ZO-1 and Gγ13. Taken together our results implicate these new interaction partners in the sub-cellular distribution of Gγ13 in olfactory and gustatory primary sensory cells.

CO-48: Les canaux TRPC3 de l'hypothalamus jouent un rôle fondamental dans la détection cérébrale du glucose et l'homéostasie énergétique

Introduction Lhypothalamus medio-basal (MBH) renferme des neurones specialises dits gluco-excites (neurones GE) capables de detecter des augmentations de la concentration en glucose. Nous venons de mettre en evidence in vitro que les canaux TRPC3 (transient receptor potential canonical type-3) sont necessaires a la reponse au glucose des neurones GE. Lobjectif de cette etude est de determiner si, in vivo, ces canaux sont effectivement impliques dans la detection cerebrale du glucose et le controle de lhomeostasie energetique. Materiels et Methodes Le poids corporel, la prise alimentaire, la tolerance au glucose et la sensibilite a linsuline ont ete mesures chez des souris deficientes pour le canal TRPC3 (souris TRPC3 KO) nourries avec un regime standard ou enrichi en gras (HFD) ou chez des souris dont le canal TRPC3 a ete selectivement delete dans le MBH (souris TRPC3MBH KO, obtenues par linjection dun adeno-associated virus exprimant la recombinase cre dans le MBH de souris TRPC3lox/lox). Resultats Les souris TRPC3 KO presentent une intolerance au glucose sans alteration de la secretion et de la sensibilite a linsuline sous regime standard. Lintolerance au glucose de ces animaux est exacerbee sous regime HFD par rapport a des animaux sauvages. La stimulation vagale de la secretion dinsuline en reponse a une injection intracarotidienne de glucose (stimulation uniquement cerebrale) et la diminution de la prise alimentaire en reponse a linjection intracerebroventriculaire de glucose sont alterees chez les souris TRPC3 KO. Enfin, les souris TRPC3MBH KO presentent une augmentation du poids corporel associee a une augmentation de la prise alimentaire sans modification significative de la tolerance au glucose six semaines apres linjection des virus. Conclusions Lensemble de ces donnees met en evidence le role clef des canaux TRPC3 du MBH dans la detection cerebrale du glucose et le controle de lhomeostasie energetique. Reste a determiner la part des canaux TRPC3 du MBH par rapport a ceux presents dans les tissus peri-pheriques (muscles) dans la regulation de lhomeostasie glucidique per se.

P187 Implication des espèces actives de l’oxygène (EAOs) et des canaux Transient Receptor Potential Canonical (TRPC) dans la sensibilité au glucose des neurones hypothalamiques

Introduction Lhypothalamus ventro-median (VMH) renferme des neurones gluco-excites suggeres comme impliques dans le controle de lhomeostasie glucidique. Hormis limplication dun canal ionique a conductance cationique non-selective (CCNS), les mecanismes mis en jeu dans la reponse au glucose de ces neurones sont inconnus. Des especes actives de loxygene dorigine mitochondriale (mEAOs) sont produites dans le VMH lors dhyperglycemie et participent aux voies de signalisation sous-tendant la detection du glucose. Certains canaux de la famille des « transient receptor potential-canonical » (TRPC), presentent une CCNS et sont modules par les mEAOs. Nous emettons lhypothese quune voie de signalisation mEAOs-TRPC-dependante est impliquee dans la reponse au glucose des neurones gluco-excites Materiels et methodes In vitro : lactivite de cellules dissociees de VMH de rats est enregistree par imagerie calcique en reponse a laugmentation de la concentration en glucose de 2,5 a 10mM, en presence dinhibiteurs de canaux TRPC ou dantioxydants. In vivo : la detection hypothalamique de lhyperglycemie est evaluee en mesurant la secretion dinsuline induite par linjection intra-carotidienne dun bolus de glucose, en presence dinhibiteurs de canaux TRPC dans le VMH. Resultats Le nombre de cellules gluco-excitees diminue de 60 % en presence dantioxydants (trolox et glutathion). Lintensite des reponses calciques au glucose des cellules gluco-excitees diminue significativement de 75 % ou totalement (100 %) en presence des inhibiteurs TRPC 2-Aminoethoxydiphenylborate ou SKF96365, respectivement. Des donnees de RT-PCR montrent que les canaux TRP-C2,3,4,6 sont exprimes dans le VMH. Lexpression de ces canaux specifiquement dans les neurones gluco-excites est en cours dexploration par RT-PCR sur cellule unique. In vivo, des donnees preliminaires montrent que linhibition pharmacologique de canaux TRPC3 diminue la secretion dinsuline induite par linjection intra-carotidienne de glucose. Conclusion Une voie de signalisation mEAOs-TRPC joue un role dans la detection hypothalamique du glucose par les neurones gluco-excites et participerait au controle de lhomeostasie glucidique.

O54 La ghréline inhibe la sensibilité hypothalamique au glucose via la signalisation mitochondriale et altère le contrôle nerveux de la sécrétion d’insuline lors du jeûne chez le rat

Objectif La detection hypothalamique du glucose intervient dans la regulation nerveuse de la secretion d’insuline. Ce controle met en jeu la production d’especes actives de l’oxygene mitochondriales (mEAOs). L’objectif etait d’etudier lors du jeune (ghreline elevee et secretion d’insuline faible) le role de la ghreline sur la sensibilite hypothalamique au glucose et finalement, la secretion d’insuline. Materiels et methodes La sensibilite hypothalamique au glucose est testee dans 3 groupes de rats : nourris, a jeun et a jeun en presence d’un antagoniste du recepteur de la ghreline (JMV3002). Les animaux recoivent une injection cerebrale de glucose qui stimule l’axe vagal hypothalamo-pancreatique. Les mEAOs hypothalamiques sont doses 1xa0min apres l’injection. Le statut mitochondrial est explore en evaluant les complexes mitochondriaux (WB), l’activite respiratoire par oxygraphie et l’environnement redox (glutathion oxyde/total). Resultats Les animaux a jeun et a jeun+JMV presentent une baisse de glycemie et d’insulinemie et une augmentation de la ghrelinemie. La secretion d’insuline en reponse a une stimulation cerebrale par le glucose est diminuee chez les animaux a jeun, mais elle est totalement restauree au niveau des rats nourris chez les rats a jeun+JMV. Les rats a jeun produisent moins de mEAOs hypothalamiques en reponse au glucose, mais cette production est restauree et equivalente a celle des rats nourris lors du traitement JMV. Les complexes I et II dans les mitochondries sont diminues a jeun, mais ces differences sont absentes avec le traitement JMV. Ceci s’accompagne par une forte diminution de la respiration mitochondriale a jeun, qui est restauree par le traitement JMV. Conclusion Ces resultats montrent donc que la ghreline inhibe la sensibilite hypothalamique au glucose via la signalisation par les mEAOs, et finalement qu’elle participe negativement au controle nerveux de la secretion d’insuline.