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Da fixação do tecido à coloração: você conhece o misterioso processo da imuno-histoquímica?
A imuno-histoquímica é uma técnica de imunocoloração que se concentra no reconhecimento seletivo de antígenos (proteínas) em células e tecidos por anticorpos. Esta técnica evoluiu da técnica de imunofluorescência desenvolvida originalmente por Albert Hewitt Coons e outros em 1941. Com o tempo, a imuno-histoquímica se tornou muito comum no diagnóstico de câncer e na pesquisa básica, ajudando cientistas a explorar a distribuição de biomarcadores e proteínas expressas diferencialmente em diferentes tecidos biológicos.
Preparação da amostra
A imuno-histoquímica pode ser realizada em tecidos que foram fixados e incluídos em parafina ou em tecidos congelados. Antes da coleta, uma série de etapas diferentes precisam ser realizadas, dependendo de como o tecido foi preservado. As etapas gerais incluem: fixação apropriada, recuperação de antígeno, incubação com anticorpos primários e incubação subsequente com anticorpos secundários.
Preparação e fixação de tecidos
A fixação do tecido é fundamental para manter a estrutura do tecido e o formato da célula. A formulação do fixador, a proporção entre fixador e tecido e o tempo de fixação afetarão significativamente os resultados finais. Formalina tamponada neutra a 10% é geralmente usada como fixador, e o tempo de fixação é geralmente de 24 horas em temperatura ambiente.
Fatia
Amostras de tecido foram seccionadas usando um micrótomo. Para tecido embebido em parafina, uma espessura de 4 mícrons é um padrão comum, enquanto cortes congelados têm normalmente de 4 a 6 mícrons de espessura. A espessura dos cortes é crítica e diferentes espessuras podem afetar a visualização dos antígenos, portanto, deve-se ter extremo cuidado ao realizar a imuno-histoquímica.
Recuperação de antígeno
Em cortes de tecido fixos, a recuperação de antígenos torna os sítios antigênicos visíveis aos anticorpos. Pontes de metano ou ligações cruzadas de grupos amino podem se formar durante a fixação, dificultando assim a ligação do anticorpo. O método mais comum de recuperação de antígeno é recuperar a antigenicidade latente por aquecimento e imersão em tampão.
Amostra de tag
A marcação de amostras pode ser realizada usando anticorpos marcados com compostos fluorescentes, metais ou enzimas para distinguir efetivamente os antígenos alvo.
Métodos de detecção
O método direto é um método de coloração de etapa única, enquanto o método indireto envolve um anticorpo primário não marcado que se liga primeiro ao antígeno alvo, seguido pela adição de um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário. Devido ao efeito de amplificação do sinal do método indireto, ele tem maior sensibilidade e é amplamente utilizado na detecção de múltiplos antígenos.
Moléculas repórteres de detecção
As moléculas repórter detectadas variam dependendo do método de detecção, sendo as mais comuns a detecção por cromógeno e a detecção fluorescente. Na imuno-histoquímica cromogênica, os anticorpos geralmente são conjugados a uma enzima e produzem uma cor visível na presença de um substrato cromogênico. Na detecção por imunofluorescência, o anticorpo é marcado com um fluoróforo.
Aplicação na prática clínica
As técnicas de imuno-histoquímica têm desempenhado um papel importante na patologia cirúrgica diagnóstica, especialmente na imunofenotipagem de tumores (por exemplo, identificação de marcadores para câncer de mama). Ela tem uma ampla gama de aplicações, incluindo neurociência e diagnóstico de tumores, ajudando pesquisadores a explorar como as proteínas se comportam em tecidos específicos.
Enfrentando o desafio
Na imuno-histoquímica, há várias etapas que podem levar a diferentes problemas, como coloração de fundo excessiva ou marcação insuficiente de antígeno.
Para resolver esses problemas, os pesquisadores precisam otimizar a qualidade e a tecnologia dos anticorpos.
ConclusãoA imuno-histoquímica não é apenas uma técnica de detecção eficaz, ela também nos permite descobrir e entender a distribuição de proteínas em tecidos biológicos. À medida que a tecnologia avança, sua aplicação em campos clínicos e de pesquisa continuará a se expandir. Você está disposto a explorar os novos horizontes que essa tecnologia pode abrir?
