G. Bastert

Human mammary cancers in nu/nu-Mice. A model for testing in research and clinic

Zusammenfassung37 (85%) von 44 menschlichen Mammacarcinomen konnten erfolgreich ohne zusätzlich immunsuppressive Therapie auf thymusaplastische nu/nu-Mäuse transplantiert werden. 16 Wochen nach der Transplantation zeigten 4 relativ schnell wachsende Tumoren einen menschlichen, weiblichen Chromosomensatz. Bei folgenden Untersuchungen fand sich eine gute Korrelation zwischen Originaltumor und Transplantat: Histologie, 3H-Thymidinmarkierungsindex und Androgen- bzw. Östrogenrezeptormuster.Summary37 (85%) of 44 human breast cancers are successfully transplanted on thymus-aplastic nu/nu-mice without adjunctive immunotherapy. 16 weeks after transplantation 4 rapidly growing tumours are showing human, female karyotypes. Subsequent investigations proved a good correlation between original tumour and transplant: histology, 3H-thymidine marking index and receptors of androgen and estrogen.

Zum Problem der in vitro-Sensibilitätstestung von Tumoren gegen Cyclophosphamid. 3H-Uridineinbau in Ribonucleinsäure menschlicher Tumorzellen nach Inkubation mit 4-Hydro-peroxy-Cyclophosphamid

The utility of 4-hydro-peroxy-cyclophosphamide for testing the selectivity of human tumours cells against cyclophosphamide in vitro was studied. 4-hydro-peroxy-cyclophosphamide in aqueous solution spontaneously decomposes to 4-hydroxy-cyclophosphamide, the primary product of metabolic activation of cyclophosphamide thus representing a new form of “activated” cyclophosphamide. From 31 human tumours including 21 mammarian-, 4 ovarial-, 2 uterine-carcinomas, 2 seminomas, 1 hypernephroma and 1 rectum-carcinoma cell suspensions were made and the effect on the 3H-Uridine- and the 3H-Thymidine-incorporation into the nucleic acids after short time incubation with the effect of 4-hydro-peroxycyclophosphamide and 4-hydroxy-cyclophosphamide. 7 malignomas showed high sensitivity both against 4-hydro-peroxy-cyclophosphamide and against 4-hydroxy-cyclophosphamide. No additional inhibitory effect of the peroxyde function besides of that of the alkylating moiety of the molecule was found. Accordingly 4-hydro-peroxy-cyclophosphamide because of its better availibility and stability may be used as “activated” cyclophosphamide in screening tests for cyclophosphamide-sensivity of human tumours in vitro. Es werden Versuche beschrieben, anstelle von 4-Hydroxy-Cyclophosphamid (dem biologischen Aktivierungsprodukt von Cyclophosphamid in vivo), das synthetisch besser zugängliche und stabilere 4-Hydroperoxy-Cyclophosphamid für die Sensibilitätstestung menschlicher Tumoren gegen Cyclophosphamid einzusetzen. 4-Hydro-peroxy-Cyclophosphamid geht in wässriger Lösung unter physiologischen Temperatur- und pH-Bedingungen spontan in 4-Hydroxy-Cyclophosphamid und dessen Folgeprodukte über und stellt demnach eine weitere Form von „aktiviertem“ Cyclophosphamid dar. Unsere Untersuchungen an 31 Tumoren (21 Mamma-, 4 Ovarial-, 2 Korpuscarcinome, 2 Seminome, 1 Hypernephrom und 1 Rektumcarcinom) zeigen, daß die Hemmung des 3H-Uridin- und des 3H-Thymidin-Einbaus in die Nukleinsäuren der Tumorzellen nach Kurzzeitinkubation mit 4-Hydro-peroxy-Cyclophosphamid und 4-Hydroxy-Cyclophosphamid praktisch gleich ist. 7 Malignome erwiesen sich in diesem Test als hochempfindlich gegenüber beiden Formen von aktiviertem Cyclophosphamid. Ein zusätzlicher Effekt der Peroxy-Funktion über den der alkylierenden N-Lostgruppe des 4-Hydro-peroxy-Cyclophosphamid hinaus war nicht meßbar. Wegen seiner besseren Verfügbarkeit und Haltbarkeit erscheint deshalb 4-Hydro-peroxy-Cyclophosphamid als aktivierte Form von Cyclophosphamid für die Sensibilitätstestung von Tumoren in vitro geeignet.

In vitro Sensibilitätstestung von Tumoren gegenüber aktiviertem Cyclophosphamid (4-Hydroxycyclophosphamid). Kurzzeitinkubation von Originaltumorzellen und 3H-Uridinbzw. 3H-Thymidineinbau

A new in vitro assay for screening the sensitivity of human tumour cells against Cyclophosphamide has been developed. While biologically activated Cyclophosphamide was unsuitable because of unpurities in the material, synthetic 4-Hydroxycyclophosphamide was shown to inhibit the incorporation of tritiated uridine and thymidine into the nucleic acids of human tumour cells in vitro. 29 tumours including 14 mammarial carcinomas, 8 ovarial carcinomas and 7 other malignant tumours were tested. While 12 tumours showed a significant and 5 only a slight inhibition of the 3H-uridine incorporation in vitro. 12 tumours showed no effect. Histologically none-differentiated tumours were more sensitive against 4-Hydroxycyclo-phosphamide as compared with the more differentiated ones. First observations point to 4-Hydroperoxycyclophosphamide instead of 4-Hydroxy-cyclophosphamide as a more suitable form of activated Cyclophosphamid for the in vitro assay of Cyclophosphamide sensitiveness because of the higher stability and better availability of this compound. Das Cytostaticum Cyclophosphamid (ENDOXAN®) wird in vivo über 4-Hydroxycyclophosphamid zur Wirkform „gegiftet“ bzw. aktiviert. Unsere Ergebnisse zeigen, daß auf biologischem Weg aktiviertes Cyclophosphamid für in vitro Tumorsensibilitätsteste ungeeignet ist, da die Versuchsergebnisse durch die zwangsläufig mit zugesetzten Fremdeiweiße bzw. Leberextrakte verfälscht werden. Diese Schwierigkeiten lassen sich mit chemisch dargestelltem 4-Hydroxycyclophosphamid umgehen. Bei 29 Tumortestungen (14 Mammacarcinome, 8 Ovarialcarcinome, 7 weitere Malignome) wurde mit Hilfe einer Kurzzeitinkubationstechnik die Einbauhemmung von 3H-Uridin und 3H-Thymidin geprüft. 12 Tumoren zeigten deutliche, 5 weitere mäßige Beeinträchtigungen des Einbaus der Nucleinsäurepräkursoren. 11 von 12 in vitro gegen 4-Hydroxycyclophosphamid empfindliche Tumoren reagierten auch gegenüber anderen Cytostatica sensibel. Histologisch entdifferenzierte Tumoren waren empfindlicher gegenüber 4-Hydroxycyclophosphamid als hochdifferenzierte Tumoren. Erste weiterführende Untersuchungen deuten darauf hin, daß das nur geringe Zeit haltbare 4-Hydroxycyclophosphamid in vitro ersetzbar ist durch 4-Hydroperoxycyclophosphamid. Diese Substanz ist bei −20° C mehrere Monate haltbar.

Human Breast Cancer in Nude Mice: A Model for Testing Endocrine Treatment

It is clinically well known that addition or deletion of steroids is an effective treatment in about one-third of patients with advanced breast cancer. However, it is difficult to predict the responsiveness of an individual tumour. In vitro assays of oestrogen receptors have proved to yield useful indications of the hormone responsiveness of human breast cancer. Nevertheless, many oestrogen receptor-positive tumours fail to respond to endocrine therapy. Supplementary markers like quantification of oestrogen receptors, differentiation of the 4 S and 8 S receptors, determination of the progesterone receptor, and certain clinical characteristics such as menopausal status, type of metastasis, and disease-free interval are additional aids in the identification of responsive tumours.

Gefahr der Fruchtwasserinfektion bei Amniocentese

11. Herren G. Bastert, E. R6mer, W. W. Stein und R. Schuhmann (Zentrum der Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Abteilung ffir Geburtshilfe, Johann Wolfgang Goethe Universit~t Frankfurt a. M.): Gefahr der Fruchtwasserinfektion bei Amniocentese. An der Universit~its-Frauenklinik Frankfurt wurden 1973 321 transabdominale Amniocentesen aus den verschiedensten Indikationen (Delta-E-Bestimmung bei Rh-Inkompatibflit~it, Reifebestimmung des Foeten, Lezithin-Sphingomyelingehalt des Fruchtwassers, Amniographie, chromosomale Diagnostik in der Frfihschwangerschaft, intraamniale Prostaglandininstillation} vorgenommen. Dahei stellt der Anteil der Repunktionen etwa 25~ aller Amniocentesen dar. In der vorliegenden Untersuchung gingen wir der Frage nach, wie hoch das Infektionsrisiko bei einer Amniocentese zu veranschlagen ist. In 108 F~illen yon Repnnktionen wurden 10 ml Fruchtwasser aerob bzw. anaerob bakteriologisch wie eine Blutkultur aufgearbeitet bzw. untersucht. In 3 F~illen fanden wit [2real Staph. albus, 1real Sarcinenl lediglich Verunreinigungen, die wahrsoheinlich beim Beimpfen der Blutkulturflaschen zustande kamen. Fakultativ pathogene Keime oder das klinische Bild einer Amnioninfektion haben wir bislang nicht beobachtet. Neben diesen in-vivo-Untersnchungen haben wit in in-vitro-Versuchen fiberprfift, ob Fruchtwasser, ~ihnlich dem Blntserum eine Eigenbakterizidie aufweist

In vitro cultivation of xenotransplanted human breast-cancer cells

SummaryXenotransplanted human breast-cancer tissue growing in the second to the ninth passage in nu/nu mice and normal tissue from nu/nu mice was cultivated in vitro. Thirty-two of fifty-two (62%) cultures grew successfully and have been analyzed. The cells were observed using phase-contrast microscopy and May-Grünwald-Giemsa staining. The following cell types could be distinguished: normal fibroblast-like cells (FC), normal epithelial-like cells (EP I), abnormal epithelial-like cells (EP II), and degenerated or dying cells (DC). After staining, the nuclear area of all cell types was measured. The results were: FC=280 μm2, EP I=320 μm2, and EP II=800 μm2. They were compared with the nuclear area of human breast-cancer cells obtained by aspiration biopsy.

Untersuchungen zur sekundären Cyclophosphamidresistenz beim menschlichen Mammakarzinom nach Xenotransplantation auf nu/nu-Mäuse

tration (10 .5 M/l) mit 75% die meisten Tumoren mit Stimulationen bzw. Inhibitionen yon mehr als 10%, wfihrend bei 10 .7 und 10 . 9 M/1 nur jeweils die Hfilfte der Karzinome Verfinderungen des Thymidineinbaues yon mehr als + 10% zeigten. Die auf der Abb. 1 dargestellten Tumorreaktionsprofile zeigen, dab es ein einheitliches Reaktionsmuster menschlicher Mammakarzinome auf die untersuchten Konzentrationen yon MPA in vitro nicht gibt. Die Reaktionspunkte der einzelnen Tumoren sind auf diesem Bild durch Striche miteinander verbunden. Ebensowenig liegen sich eindeutige Dosis-Wirkungsbeziehungen beobachten, wie sie von kultivierten Zellinien her bekannt sind. Jedes der untersuchten Mammakarzinome reagierte auf mindestens eine der getesteten MPA-Konzentrationen mit einer Stimulation bzw. Inhibition des Thymidineinbaues yon mehr als 10%. Das k6nnte darauf hindeuten, dab mehr Mammakarzinome als bisher angenommen durch MPA zu beeinflussen sind, wenn es gelingt, den ffir den einzelnen Tumor richtigen Konzentrationsbereich zu finden.

Die Interpretation von Hormonrezeptorbefunden. Untersuchungen mit dem in vivo-Modell der Nacktmaus

Der Stellenwert von Steroidhormon-Rezeptorbefunden (Ostradiolund Progesteronrezeptoren) ist heute f~ir die Prognose und Therapie des metastasierenden Mammakarzinoms unbestritten. Wenn man jedoch representative Rezeptorbestimmungen erwartet, so mfissen bestimmte Gesichtspunkte im Zusammenhang mit der Entnahme und der Lagerung tier Tumoren beachtet, sowie eine m6glicherweise vorangegangene Behandlung ber~cksichtigt werden. Mit Hilfe des Xenotransplantationsmodelle der Nacktmaus soll an rezeptorcharakterisierten menschlichen Mammakarzinomen untersucht werden, ob wesentliche Rezeptorverluste durch ein verz6gertes Einfrieren der Gewebsproben nach der Tumorentnahme bzw. w~ihrend einer Lagerung der Tumoren bei -30 °C auftreten. Ferner soll eine m6gliche Anderung der RezeptorkapazitM unter einer endokrinen, zytostatischen und radiologischen Behandlung ~iberprt~ft werden. Es werden Nacktm~iuse aus eigener Koloniezucht verwendet (NMRInu/nu, Auszuchtstamm Mutante nu) und rezeptorcharakterisierte, in Serie transplantierbare menschliche Mammakarzinome den Tieren heterotransplantiert. Fiir die P~fung eines Rezeptorverlusts durch verz6gertes Einfrieren bzw. w~ihrend der Lagerung von Tumorproben bei -30°C wird ein Pool menschlichen Tumorgewebes mit Hilfe des Xenotransplantationsmodells hergestellt, das Rezeptormuster am gepoolten Gewebe bestimmt und die einzelnen Tumorproben fraktioniert eingefroren. Die Rezeptorbestimmung (Dreifachbestimmungen) erfolgt durch Kohleadsorptionstechnik mit Scatchardanalyse und Gelelektrophorese. Bei den Untersuchungen zur Frage einer Beeinflussung des nachweisbaren Musters der Steroidhormonrezeptoren dutch endokrine, zytostatische und radiologische Therapieverfahren kommen Tamoxifen (15 mg/kg i.m./ 3. Tage in Arachis61), Medroxyprogesteronacetat (2 g/kg s. c./10 Tage) und Ostradiolvalerianat (10 mg/kg i.m./Woche) zur Anwendung, ferner Adriamycin (10% der LD 50) und Cyclophosphamid (10% der LD 50) sowie eine Tumorbestrahlung am Betatron mit Elektronen einer Energie von 10 MeV in Einzeldosen von 2 Gy bis zu einer Gesamtherddosis von 40 Gy. Das verz6gerte Einfrieren der entnommenen Tumorgewebe bzw. die Lagerung bei -30 °C hat einen raschen Abfall der Rezeptorkapazit~it, be-

Ergebnisse einer Therapie mit Cis-Platin an xenotransplantierten menschlichen Mammakarzinomen

der Tumor sein Wachstum nicht wieder auf. Die Sensibilitfitsunterschiede der Tumoren traten bei der Therapie mit 6,5 mg ADM/kg deutlicher in Erscheinung. Der Tumor SI blieb resistent, der Tumor SC ebenfalls. Der Wachstumsrfickgang bei den Karzinomen ST und KA war demgegenfiber massiver. Dieses Versuchsergebnis blieb auch bei einer Therapie mit 9,75 mg ADM/kg Maus im Prinzip gleich. 121berraschend war, dab der Tumor SI auch jetzt noch unverfindert weiter wuchs. St6rend war jedoch bei den Therapiegruppen mit 9,75 mg ADM/kg der relativ hohe Tierverlust unter der Behandlung. Demnach war eine sichere Trennung zwischen sensiblen und resistenten Mammakarzinomen bei geringstm6glichem Tierverlust mit der Dosis 6,5 mg ADM/kg Maus mOglich. Dies entspricht 50% der von uns in Vorversuchen ermittelten LDs0 von Adriamycin.

Die Kontaktnahme und das Wachstum xenotransplantierter menschlicher Mammakarzinome auf nu/nu-Mäusen

auf tier Nacktmaus, wurde festgestellt, dab alle Tumoren therapiesensibel sind, aber, dab die schnell proliferierenden Ovarialkarzinome therapeutisch besser zu beeinflussen sind, als z. B. langsam wachsende Endometriumoder Zervixkarzinome. Nebenwirkungen wurden auch nach mehrw6chiger ALP-Therapie in der Nacktmaus nicht beobachtet. Die Selektivitfit der antimetabolischen Wirkung von ALP in Tumorzellen und die damit herabgesetzten Nebenwirkungen scheinen einen grundlegenden Vorteil gegentiber herk6mmlichen Zytostatika zu bieten.