Heinrich Wrba

Vitalitätsbestimmung durch Aufnahme und Umsatz markierter Verbindungen

ZusammenfassungDie Aufnahme und der Umsatz angebotener, radioaktiv markierter Substanzen zeigt unter kontrollierbaren Bedingungen eine hohe direkte Abhängigkeit von der Vitalität der Zelle.Anorganisches Phosphat wird durch Zellen in dem gleichen Maße aufgenommen wie das Phosphation innerhalb der Zelle organisch gebunden wird.Ascitestumorzellen nehmen entsprechend der Verschlechterung ihrer Stoffwechselsituation mit steigendem Abstand von der Überimpfung in vitro geringere Mengen von anorganischem Phosphat auf. Daß diese Aufnahme in vivo spezifisch für den angebotenen Stoff ist, zeigt sich darin, daß Aufnahme und Verwertung in der Zelle in Abhängigkeit von der Bindungsform der angebotenen Substanz verschieden korreliert sind.Zur Ausschaltung von Fehlerquellen wurde ein Rührsystem entwickelt, in welchem die Aufnahme und der Umsatz angebotener Verbindungen durch suspendierte Zellen in vitro untersucht werden kann. Für anorganisches Phosphat ergibt sich in vitro eine Abhängigkeit der Aufnahmegröße vom Phosphatgehalt des Suspensionsmittels und von der Vitalität der verwendeten Zelle.Die Aufnahme höhermolekularer Verbindungen ist mit Energieverbrauch verbunden. Die Resorption solcher Verbindungen und mikroskopisch sichtbarer Partikel läßt sich durch Zusatz von Glucose beschleunigen. Ihr Ablauf gibt einen Hinweis für den Energievorrat der Zelle. Eine anschließende Trennung der Aktivität aus niedermolekularen und hochmolekularen Zellinhaltsstoffen liefert einen Hinweis für die Syntheseleistung der Zelle.Organkulturen bieten die Möglichkeit, die Aufnahme definierter Substanzen auch an organisierten Gewebsverbänden verschiedener Herkunft in Beziehung zu ihrer Vitalität zu bringen. Die Methode ist zur Objektivierung auf andereWeise nicht faßbarer Wirkungen geeignet. Organexplantate nehmen aus dem Nährboden markiertes Phosphat in einem Maße auf, das der Intensität ihres Stoffwechsels proportional ist. Denaturierte Explantate nehmen keine Aktivität auf. Embryonale Organe verwerten Phosphat aus dem Nährboden in höherem Maße als die entsprechenden erwachsenen Organe. Den Herzmuskel nimmt infolge seines höheren Nährstoffbedarfes als ausdifferenzierter Muskel mehr aktives Phosphat auf als der embryonale Herzmuskel.C14-markierte Glucose wird in vitro bei einer Dosierung unter 0,01 mg- % von Zellen des MAT quantitativ innerhalb von 5 min aufgenommen und umgesetzt. Bei Raumtemperatur ist der oxydative Abbau des Traubenzuckers schon nach l min nahezu beendet. Dabei sind 28% der Aktivität in C14O2 verwandelt. Diese von uns gewählte Aktivitätsmenge liegt weit unter der Grenze für die Auslösung der Atmungshemmung durch den sog. „umgekehrten Pasteureffekt“. In dieser Größenordnung verursacht Glucose eine Steigerung der Sauerstoffaufnähme.Andere Gewebe, Zellen aus Suspensionskulturen und Zellen des Yoshida- und Walker-Tumors nehmen dagegen C14-markierte Glucose kontinuierlich ansteigend auf. Dieser Vorgang entspricht der höheren Glucosekonzentration in diesen Geweben. Nur Zellen des Sarkoms 37 in Ascitesform reagieren wie die Zellen des MAT auf den Glucosezusatz und haben demnach den gleichen niedrigen Gehalt an Glucose im nativen Medium.Blockierung des Kohlenhydratstoffwechsels durch Hemmstoffwirkung oder durch Herabsetzung der Versuchstemperatur hat infolge der eintretenden Abbauhemmung eine scheinbare Erhöhung der Aufnahme zur Folge. Bei Zellen des MAT wird die Glucoseaufnahme von Anfang an vom oxydativen Abbau der Substanz überlagert.Herabsetzung der Vitalität der Zellen, etwa durch Röntgenbestrahlung oder Substanzwirkung, hat von einer kritischen Grenze der Schädigungsintensität eine Abbaustörung und damit einen Anstieg der intrazellulären Aktivität zur Folge. Die Umsetzungsgeschwindigkeit für aufgenommene Glucose, die sich in einem Abfall der intrazellulären Aktivitätswerte zeigt, liefert einen Hinweis auf die Integrität der energieliefernden Reaktion.Erhöhung des Glucoseangebotes hat bis zu 1 mg- % keine faßbare Wirkung. Von 10 mg- % ab steigt der intrazelluläre Aktivitätswert, weil der oxydative Abbau blockiert wird. Von höheren Dosen ab erlischt infolge der Absättigung der Zelle jede Glucoseaufnahme.Durch geeignete experimentelle Bedingungen kann man, die in der ersten Minute ablaufende oxydative Phosphorylierung und die anschließend einsetzende Glycolyse bis zu einem gewissen Grade dissoziieren. Die Aufnahme von Glucose durch Zellen des MAT hängt von der intakten Funktion des Zellmembran ab und erfordert keinen Energieaufwand durch die Zelle. Auch Zellen, die gewungen wurden, ihren Energievorrat zu verbrauchen oder Zellen, deren energieliefernde Reaktionen gehemmt wurden, können Glucose resorbieren.Es bestehen verschiedene Möglichkeiten, um zu einer Aussage über die Vitalität einer Zellpopulation zu gelangen. 1.Man kann, durch Angebot kleiner, auch anorganischer Moleküle und mittels der späteren Trennung der Zellinhaltsstoffe und durch die Beurteilung des Einbaues der angebotenen Substanz zu einer Aussage über Resorptions- und Syntheseleistung des Zellmateriales gelangen.2.Es ist möglich, durch Angebot hochmolekularer definierter Verbindungen oder durch Zufuhr von markierten Zellgranula und durch die Beurteilung ihrer Aufnahme und Verwertung Aufschlüsse über den Energievorrat der Zelle erhalten. Die Aufnahme großer Moleküle durch die Zellmembran — die Phagocytose —ist ein energieverbrauchender Vorgang. Er kann durch gesteigertes Angebot von Traubenzucker bei Zellen des MAT beschleunigt werden.3.Es gelingt, durch Untersuchung der Substanzaufnahme aus dem Nährboden durch Organkulturen sehr feine, mit keiner anderen Methode faßbare Schwankungen in der Stoffwechsellage der Explantate zu objektivieren. Auf diese Weise läßt sich die Eignung von Nährböden oder Konservierungsflüssigkeiten besonders zuverlässig bestimmen.4.Bei Blockierung des Kohlenhydratstoffwechsels liefert die Untersuchung der Aufnahme angebotener C14-markierter Glucose einen Hinweis auf die erhaltene Membranfunktion.5.Durch einen Zusatz sehr geringer Konzentrationen markierter Glucose und die anschließende Bestimmung der Verteilung der Aktivität auf Zellen und Suspensionsmittel ist es möglich, an Zellen des MAT ein Kriterium für die Integrität der energieliefernden Reaktionen zu gewinnen.

Anwendung von mit32P markierten Tumorzellen zur Bestimmung ihrer Teilungsgeschwindigkeit

Nach Literaturangaben bleibt radioaktives Phosphat auch bei Zellteilungen in den Zellen. Unter dieser Voraussetzung kann der Aktivitätsabfall in überimpften markierten Tumorzellen nach ihrer Vermehrung zur Bestimmung der Teilungsgeschwindigkeit dienen. Die Bestimmungen ergaben Übereinstimmung mit den nach anderen Methoden erhaltenen.

Die Aufnahme von markiertem Phosphat in vitro als Ma fr die Vitalitt von Tumorzellen

Die Geschwindigkei t , m i t der a2po 4 ill Zellen des EHRLICHschen M~nse -Asc i t e s -Tumors in v ivo a u f g e n o m m e n u n d eingebau t wird, i s t yon zahl re ichen F a k t o r e n abh~ngig . W i t versuch ten , zur A u s s c h a l t u n g individuel ler S c h w a n k u n g e n der Versnchsf iere h ins ich t l ich Reakt ionsweise , Al ter und T u m o r b i ldung in vi t ro in e inem R f i h r s y s t e m die A u f n a h m e g e s c h w i n d igkei t u n t e r genau reproduz ie rbaren B e d i n g u n g e n zu bes t i m m e n . Method i sch g ingen wir so vor, dab die Zellen aus ]e 20 ml des T u m o r s nach e inmal iger W a s c h u n g in R inge r l6 sung un t e r Zusa tz yon 80 ~xC H ~ 2 p o 4 in 20 ml versch iedener Medien suspend ie r t wurden . Nach fes tge legten Ze i tabs tAnden wurde die Ver te i lung der Akt iv i t i i t zwischen zellfreiem M e d i u m u n d Tumorze l len in der fibIichen Weise b e s f i m m t l ) . Der T u m o r wurde bei 38 ~ in e inem R t i h r s y s t e m yon 30 his 60 U m d r e h u n gen je Minu te au fbewahr t . Es zeigt sich, dab u n t e r d iesen B e d i n g u n g e n eine R eso rp t i onsku rve zu b e s t i m m e n ist, die m i t der jen igen in v ivo [siehe 2)] verg le ichbar ist. Der Ver lauf der Reso rp t ion ist dabei abh~ng ig yon der Vitali tXt der suspend ier ten Zellen u n d yon der E i g n u n g des NXhrmed i ums fiir die Ansprf iche der Tumorzel le . Zellen eines T u m o r s yon h 6 h e r e m Impfa t t e r bef inden s ich bei s t a rke r T n m o r e n t w i c k l u n g in schleehter S tof fwechse ls i tua t ion u n d n e h m e n auch in v i t ro in n a t i v e m Med ium I n d i k a t o r p h o s p h a t I augsamer auf als Zellen j i ingeren Impfa l te r s . Der n a c h b e s t i m m t e n Z e i t r gumen der I n k u b a t i o n au f t r e t ende Abfal l der intrazellul~iren A k t i v i t g t is t bed ing t d u t c h die Ver sch lech te rung des Zellstoffwechsels, dell beg innenden Zerfall nnd die Abgabe yon P h o s p h a t aus den Zellen. Dieser Abfal l gibt sch~rfer als irgelldein anderes I ( r i t e r ium den Augenbl ick der Ver sch lech te rung des Stoffwechsels der Zelle an. Dieser Z e i t p u n k t is t ebenfal ls von der Ve r f a s sung der exp lan t i e r t en Zelle und der Z u s a m m e n s e t z u n g der Nghr lb sung abhgngig , er t r i t t u n t e r nngf ins t igen Bed ingun gen schon n a c h elner S tnnde , n n t e r op t i mM en Verhg l tn i s sen bei der v e r w e n d e t e n Zel lar t n a c h 2,5 S td ein. Be im EHRLICHschen M~iuse-Ascites-Carcinom f indet sich nach 2 S td u n t e r op t imalen B e d i n g u n g e n ein M a x i m u m der a u f g e n o m m e n e n Ak t iv i t~ t zwischen 20 und 30% inne rha lb der Zellen, w~hrend u n t e r gleichen B e d i n g u n g e n nach 3 S td n u r noch 15 bis 20% der Ak t iv i t g t intrazel lul~r ve r anke r t sind. Dieser B e f u n d deck t sich mi t der gewebezi ichter ischen Er f ah rung , dab dieser spezielle T u m o r m i t den fibliehen M e t hoden in v i t ro n ich t zu zi ichten ist. Als en t sche idende GrbBe erweis t sich auBerdem der P h o s p h a t g e h a l t der Ni~hrl6sung. I n phospha t f r e i e r Ringer lbsung gewaschene u n d suspend ie r t e Tumorze l l en n e h m e n in der gleichen Zeit nahezu die doppel te Menge an a k t i v e m Phos p h a t au f wie Zellen, die ill n a t i v e m M e d i u m a u f b e w a h r t wet den. I n Ringer lSsung s ind nach I S td 42% u n d n a c h 2 S td 48 % der g e s a m t e n Akt iv i t~ t in die Zellen a u f g e n o m m e n , w~thr end im n a t i v e n M e d i u m n u t 22,5% nach einer u n d 36% n a c h 2 Std a u f g e n o m m e n sind. Die B e s t i m m u n g der A u f n a h m e geschwindigke i t in v i t ro liefert u n t e r der V o r a u s s e t z u n g phys iologischen P h o s p h a t g e h a i t e s der zu verg le ichenden P r o b e n einen MaBs tab ffir die VitalitS.t der Zellen u n d ftir die E i g n u n g eines M e d i u m s zur A u f b e w a h r u n g y o n Geweben. Sic i s t empf indlicher als die morphologische Beur t e i lung u nd zuverl~ssiger als die B e s t i m m u n g der O2-Aufnahme, die anch bei n ich t wachs tumsf~th igen Tnmorze l l en unver/~ndert sein kann . Diese Methode ersche in t auch zur E r p r o b u n g gee igneter Aufbewahr u n g s m e d i e n zur I~onserv ie rung isolierter t iberlebender Gewebe geeignet . Ins~itut [i~r Experime~telle KrebsJorschung der U~iversitdL Heidelberg. H. WRBA, E. SEIDLER u n d K. ALLMANN.

[A primitive heart in adult man; persistence of early forms of embryonal heart].

Bei einem 20jährigen Manne findet sich ein rechts gelagertes Herz ohne Vorhof- und Kammerscheidewand mit Bestehenbleiben der linken oberen Hohlvene und des nicht unterteilten Ohrkanals bei extremem Rechtsstand der großen Arterien und Stenose der Pulmonalis. Die Kranzarterienanlage ist rudimentär. Die Blutversorgung des Herzmuskels entspricht der embryonalen. Wahrscheinlich handelt es sich um eine Hemmungsmißbildung mit Entwicklungsstillstand von der Beendigung der Ausbildung der Ventrikelschleife an.

Untersuchung der Hemmstoffeinwirkung auf Verdopplungs-geschwindigkeit und Phosphataufnahme von Tumoren mit Hilfe von32P

Die Methode der Messung der Aktivitätsverdünnung durch Teilung von Zellen wurde zur Bestimmung der Verlangsamung der Teilung durch Hemmstoffe herangezogen. Die so erhaltenen Werte können zur als scheinbare Verdopplungszeiten bezeichnet werden, da noch virulente Zellen Aktivität aus abgestorbenen Zellen aufnehmen können; sie sind aber zur zusätzlichen Charakterisierung eines hemmstoffes geeignet. Die Aufnahmegeschwindigkeit für markiertes Phosphat in die Tumorzellen zeigte unter der Wirkung der untersuchten Hemmstoffe N-Methylcolchicamid, Trypaflavin und Patulin jedoch keinen Unterschied gegenüber unbehandelten Kontrollen.

Zur berlebenszeit von Tumorzellen in vitro unter anaeroben Bedingungen

Nach Aufbewahrung in vitro bei 37° unter anaeroben Bedingungen ergibt sich Wachstum von Ascitestumoren (Mäuseascitescarcinom und Sarkom-37-Ascites) noch bei Verimpfung nach 24 Std Aufbewahrung, bei soliden Tumoren (Ehrlich-Carcinom und Sarkom 37, verschiedene Stämme) Wachstum noch bei Verimpfung nach 12 Std Aufbewahrung unter Luftabschluß. Eine charakteristische Überlebenszeit für die von uns benutzten Geschwülste läßt sich nicht bestätigen, dagegen ist die Überlebenszeit abhängig davon, ob der Tumor als solider Tumor oder als Ascites vorliegt, in dem Sinne, daß solide Tumoren gegen länger dauernden Sauerstoffmangel empfindlicher sind.

Die Abhngigkeit der Geschwindigkeit der Aufnahme des Phosphorisotops P32 vom Alter der Geschwulst

Die Aufnahmegeschwindigkeit fur anorganisches markiertes Phosphat durch Zellen des Mauseascitescarcinoms ist abhangig vom Alter der Geschwulst. Am 5. Tage nach der Beimpfung werden innerhalb 1 Std 90% der Gesamtaktivitat aufgenommen. Eine 18 Tage alte Geschwulst nimmt im gleichen Zeitraum unter gleichen Bedingungen nur 50% der Aktivitat auf. Der Vergleich einer gewonnenen Kurve der Aufnahmegeschwindigkeit fur P32 mit festliegenden Standardkurven erlaubt eine Aussage uber Virulenz und Reaktionsweise einer beliebigen, eventuell behandelten Geschwulst.Die Aufnahmegeschwindigkeit für anorganisches markiertes Phosphat durch Zellen des Mäuseascitescarcinoms ist abhängig vom Alter der Geschwulst. Am 5. Tage nach der Beimpfung werden innerhalb 1 Std 90% der Gesamtaktivität aufgenommen. Eine 18 Tage alte Geschwulst nimmt im gleichen Zeitraum unter gleichen Bedingungen nur 50% der Aktivität auf. Der Vergleich einer gewonnenen Kurve der Aufnahmegeschwindigkeit für P32 mit festliegenden Standardkurven erlaubt eine Aussage über Virulenz und Reaktionsweise einer beliebigen, eventuell behandelten Geschwulst.

Notiz ber die berlebenszeit der Zellen des Museascitestumors in vitro unter anaeroben Bedingungen

ImEhrlichschen Mäuseascitestumor sind nach der Aufbewahrung in vitro bei 37° auch unter Luftabschluß noch nach 24 Std virulente Zellen vorhanden.

Beobachtungen ber die Wirkung des androgenen Steroidhormons Dehydroisoandrosteron bei der weien Ratte

Implantation des androgenen Steroidhormons Dehydroisoandrosteron in Tablettenform oder seine Applikation als Suspension fuhrt bei der weisen Ratte zu einer Resistenzverminderung. Es kommt zu Abscessen und zu Allgemeininfektionen durch sonst fur Ratten nicht pathogene Keime. Bei drei Versuchstieren, die langer als zwei Jahre uberlebten, entwickelten sich an der Stelle der Implantation der Substanz typische Fibrome bzw. Fibroadenome.Implantation des androgenen Steroidhormons Dehydroisoandrosteron in Tablettenform oder seine Applikation als Suspension führt bei der weißen Ratte zu einer Resistenzverminderung. Es kommt zu Abscessen und zu Allgemeininfektionen durch sonst für Ratten nicht pathogene Keime. Bei drei Versuchstieren, die länger als zwei Jahre überlebten, entwickelten sich an der Stelle der Implantation der Substanz typische Fibrome bzw. Fibroadenome.

Auslösung spezifischer Wachstumsvorgänge bei Zahnkarpfen durch ein androgenes Steroidhormon

Die beschriebenen Wucherungen an verschiedenen Organen und im lockeren Bindegewebe von Lebistes reticulatus, welche nach Anwendung von DIA auftreten, werden als Folge eines Wachstumsreizes dieses Hormons auf das embryonale, gefäßbildende Mesenchym gedeutet. Der unabhängig von der Lokalisation gleichartige Aufbau, die enge Beziehung zum Gefäßsystem, die häufig endothelial ausgekleideten zentralen Lumina sowie die Bindung der Veränderungen an neugeborene Individuen lassen die auftretenden Veränderungen als überschießende Gefäßbildungen erscheinen.