Richard Willstätter

Die Wirkungen der Chlorophyllase

Wahrend die Isolierung des Chlorophylls und die Trennung in seine beiden Komponenten ohne chemische Reaktion, namlich nur durch vorsichtige Anwendung von Losungsmitteln erfolgt, sind die krystallisierenden Alphylchlorophyllide und freien Chlorophyllide sowie ihre magnesiumfreien Verbindungen durch Umwandlung mittels einer Esterase von spezifischer Wirkung gewonnen worden, welche das Chlorophyll in den grunen Blattern begleitet und infolge ihrer Unloslichkeit nicht in die Extrakte ubergeht. Das Enzym wird als Chlorophyllase bezeichnet.

Bestimmung der Pankreatischen Fettspaltung

Es gilt als zweifelhaft, ob es moglich ist, die verschiedenen Enzyme als chemisch individuelle Stoffe ihrer Menge nach zu bestimmen, oder ob sich die Wirkung der Enzyme oder mancher von ihnen in unbestimmbarer Weise aus einer Konstellation von Kolloiden ergibt. Die beiden einander entgegenstehenden Moglichkeiten scheinen am besten ausgepragt vorzuliegen in den kohlehydratspaltenden und in den fettspaltenden Enzymen. Beim Invertin ist der Satz von der quantitativen Erhaltung der enzymatischen Wirkung, von der Unabhangigkeit von Begleitstoffen und von der Verteilung am meisten gestutzt1 Die Invertinwirkung bleibt namlich „quantitativ erhalten von der Reaktion an, die der lebende Pilz auf den Rohrzucker ausubt, bis zu dessen Hydrolyse durch das von Kohlehydraten, Eiweisstoffen, Phosphorverbindungen vollig befreite Invertinpraparat“, also auf [94] dem Weg von der lebenden Hefe bis zur 1600 fachen Konzentration in den reinsten Praparaten. „Und ohne das die enzymatische Leistung beruhrt wird, last sich das Invertin auf oberflachenaktiven Stoffen niederschlagen.“ „Die Invertinwirkung ist auch unabhangig von dem gesamten Kolloidsystem, in welches das Enzym eingebettet ist, von der Teilchengrose, von der Verteilung.“

Über die Amylasen der Leukocyten

Leukoc)~cen, aus Blur vom Pferd nach HAMBURGER frischdargestell t , geben an Glycerin Amylase ab. Sie unterscheidet sich zu unserer ~berraschung yon der pankreafischen Amylase und yon Speiehelamylase scharf dadurch, dab sie nur bei Gegenwart yon Phospha t wirkt , sie i s t wirkungslos beispielsweise mi t Acetatpuffer. Es gibt also Glykogenund St~rkeabbau mi t und ohne Beteiligung yon Phosphors~ure. Diese is t dureh Arsens~ure ersetzbar, freihch unter Verminderung der Reakfionsgeschwindigkeit , viel weniger gut durch Weins~ure, nicht dutch Zitronens~ure. Diese Amylase is t yon viel geringerer Best~indigkei t als die pankreatische. Ih r WirkungsvermGgen is t yon der Konzentra t ion der Phosphors~ure abh~ngig. Bei sehr geringer Phosphatkonzentrat ion, aber nur unter diesen Bedingungen, l~Bt es sich zeigen, dab diese Amylase durch Calciumionen bedeutend ak t iv ie r t wird. Die yon H. J. HAMBURGER beobachtete Akt ivierung der Phagocytose durch Calciumionen ist also wahrscheinlich auf die Akt i ~derung der Glykogenspal tung zurfickzuffihren. Isoliert man die Leukocyten nach dem Verfahren yon SZlL£RD, wobei das Blur kurze Zeit zuerst sauerer, dann schwach alkalischer Reakfion ausgesetzt wird, so kommt es vor (beim Blur vom Pferd und yore Hund), allerdings nicht in gut reproduzierbarer Weise, dab an Stelle des beschriebenen ein davon pr~zis unterschiedenes Enz~nn auftf i t t , das gar keinen Unterschied gegenfiber der Pankreasamylase erkennen lieB. Setzt man die nach HAMBURGER isolierten Blutzellen kurze Zeit zuerst schwach sauerer, danrI schwach alkalischer Reakt ion aus, so weisen die mi t Glycerin bereiteten EnzymlGsungen die ~¢[erkmale von Gemischen aus Phosphat-bedingender u n d Phosphat-nicht-erfordernder Amylase auf. Es is t ein gIiicklicher Umstand flit die Unterscheidung und Kennzefchnung der st~rkeund glykogenspal tenden leukocyt~ren Enzyme, dal3 es fiir sie ein so scharf unterscheidendes Merkmal wie das Phosphaterfordernis gibt. Es is t nicht das einzige. Neue charakterist ische Eigenscb~ften kommen hinzu. Leukocyt~re Amylasen sind zum Tell 16slich in Glycerin, zum Tell unlGslich. Die mi t Glycerin erschGpfend behandel ten Zellreste sind n~mlich noch in betr~ichtlichem MaBe diastat isch wirksam. Leukocyt~re Amylasen werden zum Tell durch Glycerin (schon bei m~Biger Glycerinkonzentrat ion des Versuchsansatzes) vGlhg gehemmt, zum Tell sind sie nicht hemmbar. Leukox Vortrag, gehalten in der Bayer. Akademle der Wissenschaf±en, raathemat.-naturwissenschaffl. Abteitung, am 13. Juni 193 I, mit Zus~tzen erg~nzt.

Über die Proteasen der Hefe

Unsere Untersuchung greift die Aufgabe an, die Proteasen der Hefe mit denen der hoheren Pflanzen und der Tiere in bezug auf Spezifitat, Wirkungsoptima und Adsorptionsverhalten zu vergleichen. Den Gehalt der Hefe an proteolytischen Enzymen und die Vorgange bei der Hefeautolyse haben in grundlegenden Arbeiten zuerst M. Hahn und L. Geret 1, dann umfassend und eindringend K. G. Derney 2 untersucht und weiterhin sind die verwickelten Verhaltnisse der proteolytischen Wirkungen in den Arbeiten von E. Abderhalden und A. Fodor 3 behandelt worden. Derney berichtet ausfuhrlich uber die fruhere Literatur und fast seine Kritik in folgenden Satzen zusammen: „Man hat nicht nachgeforscht, welche [251] proteolytischen Enzyme in der Hefe vorhanden sind und in welcher Beziehung diese zur Autolyse stehen. Man hat nicht den Zusammenhang zwischen Wasserstoffionenkonzentration und Autolysevorgang festgestellt.“ Indem Derney unter dem Einflus der Erkenntnisse von S. P. L. Sorensen und von L. Michaelis die Abhangigkeit der Enzymreaktion von der Wasserstoffzahl berucksichtigt, kommt er zu dem Ergebnis, das in der Hefe, in ihren Pressaften und Autolysaten ein Gemisch von folgenden drei Enzymen vorliege.

Über Spezifität der Enzyme

Der Mechanismus der enzymatischen Rohrzuckerspaltung durch das in den ublichen Kulturhefen enthaltene Invertin ist in den letzten Jahren durch bedeutsame Untersuchungen von L. Michaelis weitgehend aufgeklart worden. Die Inversionsgeschwindigkeiten, die durch eine bestimmte Enzymmenge in Rohrzuckerlosungen verschiedener Konzentration bewirkt werden, wurden von L. Michaelis und M. Menten 1 unter der Annahme gedeutet, das zwischen Enzym und Substrat ein Gleichgewicht bestehe, das durch das Massenwirkungsgesetz geregelt wird, und das die Anfangsgeschwindigkeit des Umsatzes der Konzentration der undissoziierten Rohrzucker-Invertin-Verbindung proportional sei. Die Dissoziationskonstante der Saccharase-Saccharose-Verbindung wurde bei 25° und einer [H•] von 3 · 10−5 zu 0,016 bestimmt. Aus dem Einflus von Fructose und Glucose auf die Inversionsgeschwindigkeit konnte ferner die Affinitat des Enzyms zu den Spaltprodukten ermittelt und daraus eine Reaktionsgleichung der enzymatischen Rohrzuckerspaltung theoretisch abgeleitet werden, die mit den Ergebnissen kinetischer Messungen in bester Ubereinstimmung stand. Die von L. Michaelis und H. Davidsohn 2 untersuchte Wirkung der H•-Ionen auf das Invertin kommt nach L. Michaelis und M. Rothstein 3 dadurch zustande, das der Enzymsubstratkomplex eine Saure von der Dissoziationskonstante 2 · 10−7 darstellt und das nur der undissoziierte Anteil derselben in irreversibler Weise in Enzym + Glucose + Fructose zerfallt.

Über Hemmung der Leberesterase durch Ketocarbonsäureester

Bei der Einwirkung von Leberesterase, nicht von Pankreaslipase, auf Mandelsaureathylester beobachteten wir die sonderbare Erscheinung, das langere Zeit, z. B. 60 Minuten lang, nur spurenweise Verseifung stattfindet, das aber nach Ablauf dieser Zeit die Hydrolyse des Esters plotzlich mit bedeutender Geschwindigkeit einsetzt. In gleichen Zeiten werden sodann durch das Enzym gleiche Mandelsauremengen gebildet, so das wir in der Neigung der Zeitumsatzkurven im zweiten Stadium der Reaktion ein Mas fur die enzymatische Aktivitat, in der durch Extrapolation auf der Abszisse abgeschnittenen Strecke ein Mas fur die Latenzzeit besitzen (Abb. 1 bis 5).

Zur stalagmometrischen Bestimmung der lipatischen Tributyrinhydrolyse.

Die Lipase ist im Gegensatz zum Invertin und anderen Enzymen in ihrer Wirkung vom kolloiden Zustand und der Vermischung mit Fremdkorpern in hohem Mase abhangig. Diesem Umstand vor allem mus eine Methode fur die quantitative Bestimmung des Enzyms von verschiedener Herkunft und wechselndem Reinheitsgrad Rechnung tragen. Das Wesentliche und Eigentumliche einer Lipasebestimmung liegt nicht in der Art, wie der Umsatz gemessen wird, ob beispielsweise durch Titration der entstehenden Carbonsaure oder auf Grund eines anderen Merkmals der Substratanderung. Die Brauchbarkeit einer Methode, um die Enzymmengen bei der Untersuchung tierischer Organe und Safte oder im Gang eines Reinigungsverfahrens zu vergleichen, hangt vielmehr davon ab, das man die Lipase zum Zweck der Analyse zunachst „in ein geeignetes System bringt, sei es unter Aktivierung oder unter Hemmung, um die Unterschiede im Wirkungsvermogen auszugleichen, das je nach Menge und Natur der Begleitstoffe wechselt“. Das ist der Sinn unserer vor kurzem [2] veroffentlichten1 Bestimmungsweisen der pankreatischen Fettspaltung, entweder mit Hemmung durch zugefugtes Albumin bei konstant saurer Reaktion oder mit Aktivierung durch Albumin und Calciumchlorid, sei es in konstant alkalischem Medium oder mit Wechsel vom alkalischen zum sauren Gebiet. Die gebildete Fettsaure wurde titriert. Diese Methode bewahrte sich bei der Analyse von Lipase in der Druse und ihren Auszugen und in einer Folge von Adsorptionen mit verschiedenen Mitteln und Elutionen aus den Adsorbaten.

Blausäure-Aktivierung und -Hemmung pflanzlicher Proteasen

Fur die Protease aus dem Milchsaft von Carica Papaya hat Cyanwasserstoff die Bedeutung einer Kinase, die, in zeitlichem Verlauf mit dem Enzym reagierend, seine Aktivitat erhoht und zudem seinen Spezifitatsbereich erweitert. Das Papain wirkt peptonisierend, es vermag Gelatine zu hydrolysieren, indessen nicht tiefgreifend, aber es ist nicht imstande, Peptone abzubauen. Das Papaincyanhydrin hydrolisiert Gelatine weitgehend, es spaltet Peptone. Zu diesem Spezifitatsunterschied, von dem unsere erste Mitteilung1 handelte, kommt ein weiterer hinzu; Papain selbst wirkt nicht auf genuines Eieralbumin, wahrend es zusammen mit Blausaure dazu imstande ist. Papain ohne Aktivator kann wegen seiner engeren Spezifitat mit Trypsin verglichen werden, andererseits sind die Systeme Papain + Blausaure und Trypsin + Enterokinase, insofern sie sowohl peptonbildend wie auch peptonspaltend sind, als Analoge zu betrachten. Unter Trypsin ist hier im Sinne der letzten [287] Ergebnisse von E. Waldschmidt-Leitz und A. Harteneck 1) das erepsinfreie Enzym verstanden. Die Aktivierung des Papains durch Cyanwasserstoff ist eine so ausgepragte Erscheinung, das sie sich zur Kennzeichnung der proteolytischen Enzyme der Pflanzen besonders eignet. Der Vergleich pflanzlicher Proteasen, den wir im folgenden beginnen, zeigt, das es unter ihnen tryptische Enzyme gibt, die durch Blausaure aktiviert und solche, die durch sie gehemmt werden. Die verschiedenen Falle haben also das gemeinsame, das das Enzym durch die Verbindung mit dem Zusatzstoff Anderungen seines Reaktionsvermogens erleidet, sei es im Sinne der Vermehrung oder Verminderung seiner Aktivitat.

Zur Kenntnis der Hefemaltase

Den Einflus der Wasserstoffzahl auf die Wirkung der Maltase haben L. Michaelis und P. Rona 2 eingehend untersucht und R. Willstatter und W. Steibelt 3 in einigen Versuchen gepruft. Danach soll die Wirkung optimal sein bei p H=6,1 bis 6,8 und bei = 7,26 schwacher als bei p H = 5,85 (nach Abb. 5 der Abhandlung von Michaelis und Rona, vgl. nachstehende Abb. 1), bei p H = 7,5 geringer als bei p H = 5,38 (Abb. 2 von Michaelis und Rona).

Zur Kenntnis des Trypsins

Als in der zweiten Arbeit1 dieser Reihe die Trennung der drei wichtigsten pankreatischen Enzyme mittels der Adsorptionsmethode ausgefuhrt wurde, beanspruchte der Nachweis des Trypsins nur die Bedeutung einer vorlaufigen vergleichenden Schatzung. Wie bald aus der Untersuchung von E. Waldschmidt-Leitz 2 uber Enterokinase hervorging, kann sich bei der Trennung des Trypsins von den begleitenden Enzymen sein Kinasegehalt andern. Die Enterokinase unterscheidet sich namlich vom Trypsin durch ausgepragtere Adsorptionsaffinitat. Sie last sich durch Adsorption mit Tonerde bei saurer Reaktion dem Komplexe von Trypsin + Kinase entziehen, so das in der Restlosung das kinasefreie Trypsin zuruckbleibt. Wenn also das Trypsin im Adsorptionsgange jener Arbeit aus vollaktiviertem in unvollstandig aktivierten Zustand gelangen kann, so ist es notig, das Enzym fur jede Bestimmung mit Enterokinase aufzuladen.