Wilhelmine Siebs

Beobachtungen zur Struktur des Nucleolus in normalen Zellen sowie in Tumorzellen

Der Aufbau des Nucleolus verschiedener Zellarten (Mensch, Hühnchen, Maus und Ratte) wurde an in vitro gezüchteten Zellen untersucht. Durch Abwandlung der Ernährungsbedingungen, durch Zusatz verschiedener Stoffe und durch Ultraviolettbestrahlung läßt sich der gewöhnlich von Nucleolarsubstanz verhüllte strukturierte Anteil des Nucleolus sichtbar machen. Auch an unbeeinflußt in vitro gewachsenen Zellen sind gelegentlich nucleolare Fadenstrukturen zu beobachten. Diese dürften den zuerst von Borysko und Bang und von Bernhard, Haguenau und Oberling elektronenmikroskopisch dargestellten fädigen Gebilden im Nucleolus sowie den von Estable und Sotelo als “Nucleolonema” beschriebenen Strukturen entsprechen. Der Nucleolus der von uns untersuchten Zellarten läßt sich in Übereinstimmung mit Estable und Sotelo als ein aus 2 Anteilen bestehendes Gebilde definieren, nämlich aus 1. einem unstrukturierten mit Pyronin anfärbbaren Anteil und 2. einem strukturierten Anteil. Abweichend von der von Estable und Sotelo vertretenen Meinung sehen wir auf Grund der von uns nachgewiesenen Anfärbbarkeit der Strukturen mit Methylgrün oder nach Feulgen diese als Chromosomenanteile an.

Wirkung von Ozon auf Mäuseascitestumorzellen und auf Hühnerfibroblasten in der Gewebekultur

Mäuseascitestumorzellen wurden in vitro mit Ozon behandelt und die Wirkung auf die Transplantierbarkeit, auf Atmung und Glykolyse und auf das UV-Absorptionsspektrum der Zellsuspensionen untersucht. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß die Ozonwirkung vorwiegend gegen die Zellmembran gerichtet ist. Dies folgt u. a. aus einem starken Anstieg der UV-Absorption in den Zellsuspensionen nach Behandlung mit Ozon. Dieser Anstieg beruht auf physikalischen Effekten und wird durch den Austritt absorbierender Zellinhaltsstoffe in das Medium verursacht. Atmung und Glykolyse fielen bei Einwirkung eines kontinuierlichen Gasstromes von 5% Ozon nach wenigen Minuten unter die Nachweisgrenze ab, während die Transplantierbarkeit erst nach 20 min Behandlungsdauer erlosch. Die Glykolyse wurde stärker gehemmt als die Atmung, was besonders bei diskontinuierlicher Einwirkung kleiner Ozonmengen (20–55 γ/ml Zellsuspension) zum Ausdruck kam. An Gewebekulturen embryonaler Hühnerfibroblasten waren nach 30 min Inkubation in einem Gasraum mit 1–10 γ O3/ml starke, vorwiegend unspezifische Veränderungen an Interphase- und Mitosezellen zu beobachten (Abrundung bzw. völlige Auflösung von Zellen, Schrumpfkerne, Verklumpung von Metaphasechromosomen). Die Effekte traten nur in der einschichtigen Randzone der Kulturen sowie in der obersten Zellschicht des mehrschichtigen Mittelstückes auf, was für eine geringe Tiefenwirkung des Ozons spricht. Als Folgestadien gestörter Mitosen waren nach einigen Stunden einkernig rekonstruierte, tetraploide Zellen und zwei- bis mehrkernige Zellen vertreten. Vereinzelt wurden auch Zellen mit Anaphase- und Telophasebrücken sowie mit Kernfragmenten festgestellt, ähnlich den nach Röntgenbestrahlung (600 r) beobachteten Störungen. Mouse ascites tumor cells were treated with ozone in vitro and the effects on viability, respiration, glycolysis and on the UV-absorption of the cell suspensions were studied. The results indicate a preferential action of ozone upon the cell membrane. This is shown by a marked increase of the UV-absorption in cell suspensions after ozone treatment. This increase reflects physical changes which result from the leakage of UV-absorbing material into the medium. Respiration and glycolytic activity fell to zero after few minutes treatment with 5% ozone. Tumor inducing capacity, however, was destroyed only after 20 minutes ozone treatment. Glycolytic activity was affected more than oxygen uptake, particularly in experiments with low doses of ozone. Tissue cultures of embryonic chick fibroblasts exhibited strong but mainly unspecific alterations of both interphase and mitotic cells after 30 min exposure to 1–10 γ/ml gaseous ozone (rounded or lysed cells, shrinked nuclei, clumped metaphase chromosomes). These abnormal cells were detected only at the margin (monolayer part) of the cultures and in the top layer of the middle piece, indicating little penetration effect of ozone. Several hours after exposure to ozone abnormally reconstructed cells were present with one (tetraploid), two, or more nuclei. They apparently were derived from arrested or retarded mitotic cells. A small number of cells were found with chromosome bridges in anaphase and telophase and with nuclear fragments, resembling cells with X-ray induced chromosome aberrations.

Zur Struktur des Nucleolus

3. Du tch E inwi rkung frischen Keimenbreies auf t -Dopa en t s tehen H y d r o x y t y r a m i n lind eine weitere, IIicht n~her bekann te diphenolische Substanz. Diesetbe Umwand lung kann jedoch auch nach Einwirki ing gekochten Breies beobach te t werdeii und sogar nach 36sti indigem Stehenlassen reiner Dopa16sungen im Thermos ta ten . Der Verdacht , dab das E n t s t e h e n yon H y d r o x y t y r a m i n aiif bakterielle Verunreinigung znrtickzufiihren ist, scheint dadilrch berecht ig t zu seiii, dab es geniigt, die DopalSsiiiig mi t eiiier Toluolschicht zu fiberdecken, um jede Bildiing voil H y d r o x y t y r a m i n zu verhindern.

Beobachtungen am Nucleolus in vitro gezchteter Zellen

Es werden Befunde anderer Autoren über den Nucleolus sezernierender und wachsender Zellen an Schnittpräparaten und Gewebekulturen angeführt. Eigene Beobachtungen an Gewebekulturen werden mitgeteilt. Der Nucleolus stellt sich als ein Kernbestandteil dar, an dessen Aufbau sowohl Strukturen chromosomaler Natur (Methylgrün-anfärbbar) als auch amorphe Substanz (Pyronin-anfärbbar) beteiligt sind. Der Form nach handelt es sich um ein sehr variables Gebilde. Normale Fibroblasten und Tumorzellen, die unter den üblichen Bedingungen in vitro gezüchtet werden, geben in der Interphase nucleolare Substanz an das Cytoplasma ab. Die Ausschleusung derselben erfolgt gebahnt, analog dem vonAltmann für sezernierende Zellen beschriebenen intrachromosomalen Transport von Nucleolarmaterial zur Kernmembran. Juxtanucleäre Vacuolen sowie die auch vonFrederic beobachtete Mitochondrienansammlung kennzeichnen häufig den Ort des Substanzaustritts im Cytoplasma. Zellschädigungen verschiedener Genese und verschiedenen Grades lassen mehr oder weniger hochgradige Veränderungen des Nucleolenbildes erkennen. Als Ausdruck einer solchen Schädigung wird die massive Ausstoßung von Nucleolarmaterial angesprochen, die gelegentlich unter Aufreißen der Kernmembran erfolgt. Bei fehlender Eröffnung der Kernwand können Kernausstülpungen und deren Abschnürung in Erscheinung treten. Die Abgabe von Nucleolarsubstanz während der Interphase wird als ein dem cytoplasmatischen Wachstum zugeordneter Prozeß angesehen. Es wird der möglicherweise bestehende Zusammenhang zwischen der vonEstable undSotelo für die Anaphase sowie der vonRattenbury undSerra für die Telophase beschriebenen Bildung von Pronucleolarsubstanz an allen Chromosomen und der vonBeermann an polytänen Chromosomen nachgewiesenen organspezifischen Strukturmodifikation von Querscheiben diskutiert. Es erscheint für die Krebsforschung von Interesse, bei der Austestung von Substanzen den Vorgängen am Nucleolus Aufmerksamkeit zu widmen.

Some studies with analogues of kinetin

Abstract Compounds of similar structure to kinetin (6-furyl-amino-purine) have been studied with regard to their action on animal or human cells in tissue cultures. Of the compounds, two are derivatives of biogenic amines, 6-pury1-tryptamine and 6-pury1-histamine. The first induces disturbances of mitosis of normal and malignant, animal and human cells, while the second compound is cytotoxic against tumour cells, but showed no effect on normal fibroblasts.

Untersuchungen zur Argentaffinreaktion des Nukleolus

SummaryA silver impregnation method was applied to human tumor cells of the HeLa strain growing in vitro. Preparations of the same series were examined with both light and electron microscopes. The following results were obtained with respect to the specific affinity for silver of the filamentous structures of the nucleoli, which have been designated “nucleolonema” by Estable and Sotelo: 1.The silver reaction depends on the particular fixative used.2.After fixation with OsO4 some of the components of the nucleolus are clearly distinguishable with the electron microscope, apparently as a result of extraction of certain constituents of the nucleolus during the impregnation process. Silver grains are deposited on the surface of chromosomal fibrillae both inside and outside the nucleoli.3.After formaldehyde or glutaraldehyde fixation rosary-like structures are visible within the nucleolus, when viewed with the light microscope. Dense aggregation of the filaments, which are here and there strongly impregnated with silver, gives the impression of a continuous deposition of silver along these filamentous structures. It is evident from electron microscope examination, however, that the areas with an affinity for silver, which is discontinuously distributed along the filaments, are actually parts of a filamentous structure.4.This observation of a filamentous structure is confirmed in cultures pretreated with adenosine after which there is an “unfolding” of the filamentous structures. They thus become visible over longer distances, as shown by both light and electron microscopes. We conclude that the “nucleolonema” is a complex structure made up of different components, only part of which may be identifiable after a given technique. The following components have been demonstrated: deoxyribonucleoprotein, ribonucleoprotein, and a component reacting under special conditions with silver, which may be a lipoprotein. This interpretation of the “nucleolonema” as a complex structure reconciles certain here-to-fore seemingly-contradictory concepts of the nature of the “nucleolonema”.ZusammenfassungBei Silberimprägnationsversuchen an in vitro gezüchteten menschlichen Tumorzellen (Stamm HeLa) wurden Präparate der gleichen Serie sowohl mit dem Lichtals auch mit dem Elektronenmikroskop untersucht.Hinsichtlich der spezifischen Argentaffinität der fädigen Strukturen des Nukleolus (von Estable und Sotelo als „Nucleolonema“ bezeichnet) konnte festgestellt werden: 1.Das Ergebnis der Argentaffinreaktion ist abhängig von der verwendeten Fixierung.2.Nach OsO4-Fixierung, offenbar infolge der Extraktion von Bestandteilen des Nukleolus in den Imprägnationsbädern, lassen sich im Elektronenmikroskop einige der Komponenten des Nukleolus besonders deutlich darstellen. Infolge Anlagerung von Silberkörnern treten die chromosomalen Strukturen im Kernraum und innerhalb des Nukleolus gut hervor.3.Bei Formaldehyd- oder Glutaraldehydfixierung werden im Lichtmikroskop perlschnurartige Strukturen innerhalb des Nukleolus sichtbar; bei dichter Lagerung der Fäden, die stellenweise stark imprägniert sind, kann der Eindruck einer kontinuierlichen Silberanlagerung an die Fadenstrukturen hervorgerufen werden. Im Elektronenmikroskop zeigt sich jedoch, daß es sich um granuläre argentaffine Bezirke handelt, welche diskontinuierlich einer fädigen Struktur zugeordnet erscheinen.4.Das Vorkommen einer fädigen Struktur läßt sich durch Vorbehandlung der Kulturen mit Adenosin bestätigen. Durch die Wirkung des Adenosins werden die fädigen Strukturen „entfaltet“ und können sowohl im Lichtals auch im Elektronenmikroskop über längere Strecken sichtbar gemacht werden. Das „Nucleolonema“ wird als eine komplexe Struktur definiert, von deren verschiedenen Komponenten, entsprechend der angewandten Methode, jeweils nur ein Teil dargestellt wird. Im fädigen Teil des Nukleolus haben sich folgende Komponenten nachweisen lassen: Desoxyribonukleoprotein, Ribonukleoprotein und eine Komponente, welche sich durch die Argentaffinreaktion darstellen läßt und vermutlich aus Lipoprotein besteht. Diese Auffassung des „Nucleolonemas“ als komplexe Struktur würde die scheinbaren Widersprüche erklären, welche bisher in bezug auf die Natur des „Nucleolonemas“ bestehen.

Zur Entstehung chromatinfreier Cytoplasmen durch Teilung

Zellfragmente ohne Kern kSnnen noch tiber eine bestimmte Zeitspanne zu Stoffweehselund Funktionsleistungen bef~thigt sein. Experimentell kfnnen sic aus geeigneten Objekten durch meehanisehe Entfernung des Zellkerns hergestellt werden (Alge Acetabularia nach H ~ t m m e r l i n g [1], AmSbe, z .B. nach B r a c h e t [2]). E . B . H a r v e y [3] konnte kernlose Plasmafragmente der Eier yon Arbacia punctulata dutch Zentrifugierung erhalten und parthenogenetisch zur Entwicklung bis zum Blastulastadium anregen. F a n k h a u s e r [4] hat Cytasterkeime beschrieben, bei denen die Kernteilung nicht abl~uft, abet gut zellulierte Blastulae mit kernlosen Zellen entstehen. Diese beiden Beispiele zeigen, dab such die Teilung eines kernlosen Plasmas mSghch ist. Die kernlosen Erythroeyten der S~ugetiere entstehen dutch eine Trennung yon Kern und Plasma der Erythroblasten im Knochenmark, wie yon M. A l b r e c h t [5] an in vitro geztiehtetem Knochenmark demonstriert werden konnte. Aus den bisherigen Erfahrungen ergibt sieh, dab kernlose Plasmen fiber eine gewisse Zeit existenzf~hig sind und bei geeigneten Objekten auch Teilungen durchffihren kSnnen. Ihre Entstehung erfolgt meist auf kfinstliehem Wege. Der wichtige physiologische Fall der Bildung der kernlosen Erythrocyten besteht in einer speziellen Form der Trennung yon Kern und Plasma. Ihre BildungsmSgliehkeit dutch eine StOrung der mitotischen Zellteilung ist in den erw~Lhnten Beobaehtungen yon F a n k h a u s e r schon angedeutet. Als Beispiele seien folgende F~tlle experimentell induzierter Abschntirung kernloser Plasmateile erw~hnt: 1. 1951 wurde bei unseren Versuehen der lnaktivierung der Mitochondrien in lebenden Zellen in vitro eine Abschntirung yon Plasmateilen beobachtet, die frei yon Mitochondrien waren [6]. Derartige Plasmafragmente zeigen eine st~ndige Form~nderung und regellose Bewegungen und sind nach unseren bisherigen Erfahrungen nur tiber einige Stunden existenzf/~hig. 2. 1954 beschrieb M. A l b r e c h t [7] ein spe-