Ulrike Keller

Detailed Analysis of DNA Repair and Senescence Marker Kinetics Over the Life Span of a Human Fibroblast Cell Line

We examined phosphorylation of H2AX, a marker for DNA double-strand breaks over the life of a human fibroblast cell line. This marker was compared with a number of other cellular senescence and DNA repair endpoints. An increase in γH2AX foci number was observed after 24 hours of repair time following DNA damage over the course of fibroblast passaging. Progressive and relatively constant changes in growth retardation, doubling time, and telomere length were also observed. The fraction of cells expressing β-gal, a marker of cellular senescence, increased considerably around the 40th passage as did some other cell morphology endpoints. The detectable γH2AX foci at 24 hours after ionizing radiation were far fewer than the number detected at 1 hour across all passage numbers. We conclude that although residual DNA damage level increases with passage number, it is unlikely to be the result of less efficient DNA repair in the aged fibroblast since most DNA damage is repaired, even at late passages.

Impact of various parameters in detecting chromosomal aberrations by FISH to describe radiosensitivity.

Background and Purpose:Analysis of radiation-induced chromosomal aberrations is regarded as the “gold standard” for classifying individual radiosensitivity. A variety of different parameters can be used. The crucial question, however, is to explore which parameter is suited best to describe the differences between patients with increased radiosensitivity and healthy individuals.Patients and Methods:In this study, five patients with severe radiation-induced late effects of at least grade 3, classified according to the Radiation Therapy Oncology Group (RTOG), and eleven healthy individuals were examined retrospectively. Peripheral blood lymphocytes were irradiated in vitro with 0.7 Gy and 2.0 Gy prior to cultivation and stained by means of three-color fluorescence in situ hybridization (FISH). The detailed analysis was focused on the number of breaks per metaphase, on breaks from complex chromosomal rearrangements per metaphase, as well as on the percentage of translocations, dicentric chromosomes, breaks, and excess acentric fragments—each in comparison with the total number of mitoses analyzed.Results:Using the number of breaks from complex chromosomal rearrangements after 2.0 Gy, radiosensitive patients as endpoint were clearly to be distinguished (p = 0.001) from healthy individuals. Translocations (p = 0.001) as well as breaks per metaphase (p = 0.002) were also suitable indicators for detecting differences between patients and healthy individuals. The parameters “percentage of dicentric chromosomes”, “breaks”, and “excess acentric fragments” in comparison to the total number of mitoses analyzed could neither serve as meaningful nor as significant criteria, since they showed a strong interindividual variability.Conclusion:To detect a difference in chromosomal aberrations between healthy and radiosensitive individuals, the parameters “frequency of breaks per metaphase”, “complex chromosomal rearrangements”, and “translocations” are most suitable.Hintergrund und Ziel:Die Analyse chromosomaler Aberrationen wird als „Goldstandard“ angesehen, um individuelle Strahlenempfindlichkeit zu detektieren. Eine Vielzahl von verschiedenen Parametern kann verwendet werden. Die Frage stellt sich, welche Parameter die Unterschiede zwischen Patienten mit erhöhter Strahlenempfindlichkeit und Kontrollpersonen am besten detektieren.Patienten und Methodik:Retrospektiv wurden fünf Patienten mit klinisch manifestem Strahlenempfindlichkeitssyndrom (RTOGGrad 3) und elf gesunde Kontrollpersonen untersucht. Dabei wurden periphere Blutlymphozyten vor der Kultivierung mit 0,7 Gy und 2,0 Gy bestrahlt und mittels Drei-Farb-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) angefärbt. Die Analyse bezog sich auf die Anzahl der Brüche pro Metaphase, die Anzahl der komplexen Aberrationen pro Metaphase sowie auf den Anteil von Translokationen, dizentrischen Chromosomen, Brüchen und zusätzlichen azentrischen Fragmenten an der Gesamtzahl der analysierten Mitosen.Ergebnisse:Mit Hilfe des Parameters „Brüche aus komplexen Aberrationen pro Metaphase“ bei 2 Gy konnten erhöht strahlenempfindliche Patienten als Endpunkt klar von Kontrollen unterschieden werden (p = 0,001). Des Weiteren waren sowohl Translokationen (p = 0,001) als auch Brüche pro Mitose (p = 0,002) geeignete Indikatoren für die Unterscheidung von Kontrollpersonen und erhöht strahlenempfindlichen Patienten. Die Parameter „Anteil der dizentrischen Chromosomen“, „Anteil der Brüche“ und „Anteil der zusätzlichen azentrischen Fragmente“—alle bezogen auf die Gesamtzahl der analysierten Mitosen—konnten nicht als signifikante Kriterien herangezogen werden, da sie eine große interindividuelle Variabilität zeigten.Schlussfolgerung:Um einen Unterschied in den chromosomalen Aberrationen zwischen Kontrollpersonen und erhöht strahlenempfindlichen Individuen darzustellen, sind die Parameter „Brüche pro Metaphase“, „komplexe chromosomale Aberrationen“ und „Translokationen“ am besten geeignet.

Individual radiosensitivity does not correlate with radiation-induced apoptosis in lymphoblastoid cell lines or CD3+ lymphocytes

Background and Purpose:Spontaneous and radiation-induced apoptosis of lymphoblastoid cell lines (LCLs) derived from healthy donors, cancer patients and donors with radiosensitivity syndromes as well as CD3+ lymphocytes from patients with ≥ grade 3 late toxicity were investigated as a possible marker for the detection of individual radiosensitivity. These investigations are based on the hypothesis that hypersensitive patients have reduced levels of apoptosis after in vitro irradiation as a result of a defect in the signaling pathway.Material and Methods:Epstein-Barr virus-(EBV-)transformed LCLs derived from five healthy donors, seven patients with heterozygous or homozygous genotype for ataxia-telangiectasia or Nijmegen breakage syndrome and five patients with ≥ grade 3 late toxicity (RTOG) were investigated. In addition, CD3+ lymphocytes from 21 healthy individuals and 18 cancer patients including five patients with a proven cellular hypersensitivity to radiation were analyzed. Cells were irradiated in vitro with a dose of 2 and 5 Gy and were incubated for 48 h. Apoptotic rates were measured by the TUNEL assay followed by customized image analysis.Results:Four out of seven radiosensitivity syndrome patients were identified to have an increased cellular radiosensitivity as determined by reduced apoptotic rates after irradiation of their respective LCLs. Comparatively, only two of the five hypersensitive cancer patients were clearly identified by reduced apoptotic rates. Spontaneous apoptotic rates were very homogeneous among all 39 samples from controls and patients, while lymphocytes of all cancer patients showed significantly lower radiation-induced rates.Conclusion:Only a subgroup of hypersensitive patients may be identified by reduction of radiation-induced apoptotic rate. It is concluded that the hypothesis according to which hypersensitive cells have reduced levels of apoptosis is only conditionally true. The authors suggest that this assay can be used in combination with additional tests evaluating DNA double-strand break repair, cell-cycle control and chromosomal aberrations for the evaluation for individual hypersensitivity.Hintergrund und Ziel:Spontane und strahleninduzierte Apoptose in lymphoblastoiden Zelllinien (LCL) von Gesunden, Krebspatienten und Spendern mit Strahlenempfindlichkeitssyndromen sowie in CD3+-Lymphozyten von Patienten mit Spättoxizität ≥ Grad 3 wurden mit dem Ziel untersucht, Apoptose als einen Marker zur Detektion von Strahlenempfindlichkeit zu verwenden. Dies basiert auf der Hypothese, dass erhöht strahlenempfindliche Zellen auf In-vitro-Bestrahlung mit erniedrigten Apoptoseraten reagieren, was durch eine Störung in der Signaltransduktion bedingt ist.Material und Methodik:Epstein-Barr-Virus-(EBV-)transformierte LCL von fünf gesunden Spendern, sieben Patienten mit heterozygotem oder homozygotem Genotyp für Ataxia teleangiectatica oder Nijmegen-Breakage-Syndrom und fünf Patienten mit Spättoxizität ≥ Grad 3 (RTOG) wurden untersucht. Zusätzlich wurden CD3+-Lymphozyten von 21 Gesunden und 18 Krebspatienten einschließlich fünf Patienten mit nachgewiesener Strahlenempfindlichkeit untersucht. Die Zellen wurden in vitro mit 2 und 5 Gy bestrahlt und für 48 h inkubiert. Die Apoptoseraten wurden mit dem TUNEL-Assay und einem selbst entwickelten Bildanalysesystem gemessen.Ergebnisse:Nur vier der sieben Patienten mit Strahlenempfindlichkeitssyndromen wiesen eine durch erniedrigte Apoptoseraten belegte zelluläre Strahlenempfindlichkeit auf. Entsprechend konnten nur zwei der fünf erhöht strahlenempfindlichen Krebspatienten durch erniedrigte Apoptoseraten identifiziert werden. Die spontanen Apoptoseraten der Lymphozyten aller 39 Patienten und Kontrollen waren in sich sehr ähnlich, während die Lymphozyten der Krebspatienten erniedrigte strahleninduzierte Apoptoseraten aufwiesen.Schlussfolgerung:Nur eine Untergruppe der erhöht strahlenempfindlichen Patienten kann durch erniedrigte Apoptoseraten identifiziert werden. Die Hypothese, dass strahlenempfindliche Zellen mit reduzierten Apoptoseraten auf In-vitro-Bestrahlung reagieren, gilt nur teilweise. Für die Detektion von erhöhter Strahlenempfindlichkeit wäre eine Kombination mit anderen Tests, die die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur, Zellzykluskontrolle und chromosomale Aberrationen untersuchen, zu empfehlen.

Individual radiosensitivity in a breast cancer collective is changed with the patients' age.

Abstract Background. Individual radiosensitivity has a crucial impact on radiotherapy related side effects. Our aim was to study a breast cancer collective for its variation of individual radiosensitivity depending on the patients’ age. Materials and methods. Peripheral blood samples were obtained from 129 individuals. Individual radiosensitivity in 67 breast cancer patients and 62 healthy individuals was estimated by 3-color fluorescence in situ hybridization. Results. Breast cancer patients were distinctly more radiosensitive compared to healthy controls. A subgroup of 9 rather radiosensitive and 9 rather radio-resistant patients was identified. A subgroup of patients aged between 40 and 50 was distinctly more radiosensitive than younger or older patients. Conclusions. In the breast cancer collective a distinct resistant and sensitive subgroup is identified, which could be subject for treatment adjustment. Preliminary results indicate that especially in the range of age 40 to 50 patients with an increased radiosensitivity are more frequent and may have an increased risk to suffer from therapy related side effects.