Wolfgang Grassmann

Über die Proteasen der Hefe

Unsere Untersuchung greift die Aufgabe an, die Proteasen der Hefe mit denen der hoheren Pflanzen und der Tiere in bezug auf Spezifitat, Wirkungsoptima und Adsorptionsverhalten zu vergleichen. Den Gehalt der Hefe an proteolytischen Enzymen und die Vorgange bei der Hefeautolyse haben in grundlegenden Arbeiten zuerst M. Hahn und L. Geret 1, dann umfassend und eindringend K. G. Derney 2 untersucht und weiterhin sind die verwickelten Verhaltnisse der proteolytischen Wirkungen in den Arbeiten von E. Abderhalden und A. Fodor 3 behandelt worden. Derney berichtet ausfuhrlich uber die fruhere Literatur und fast seine Kritik in folgenden Satzen zusammen: „Man hat nicht nachgeforscht, welche [251] proteolytischen Enzyme in der Hefe vorhanden sind und in welcher Beziehung diese zur Autolyse stehen. Man hat nicht den Zusammenhang zwischen Wasserstoffionenkonzentration und Autolysevorgang festgestellt.“ Indem Derney unter dem Einflus der Erkenntnisse von S. P. L. Sorensen und von L. Michaelis die Abhangigkeit der Enzymreaktion von der Wasserstoffzahl berucksichtigt, kommt er zu dem Ergebnis, das in der Hefe, in ihren Pressaften und Autolysaten ein Gemisch von folgenden drei Enzymen vorliege.

Über die Proteinase und die Polypeptidase der Hefe

Die proteolytische Wirksamkeit des nach dem Verfahren von E. Buchner und M. Hahn 3 gewonnenen Hefepressaftes haben als erste M. Hahn und L. Gerbt 4 beobachtet und in grundlegenden Arbeiten untersucht. Nach der Auffassung dieser Autoren stellt das proteolytische Enzym der Hefe, die „Hefeendotryptase“ „einen neuen Typus der Verdauungsenzyme insofern dar, als es bezuglich der notigen Reaktion den peptischen, in bezug auf die Verdauungsprodukte den tryptischen Enzymen entspricht, in seinem Verhalten gegen die Peptone aber mit keinem der bekannten Enzyme ubereinstimmt“. Als erster hat S. H. Vines 5 gestutzt auf seine umfangreichen Beobachtungen aus dem Gebiete eiweisspaltender Pflanzenenzyme, die Meinung verfochten, das die proteolytische Wirkung der Hefe und vieler anderer pflanzlicher Proteasematerialien auf ein System aus zwei Komponenten zuruckzufuhren sei, von denen die eine („Peptase“) Eiweiskorper unter Peptonbildung auflosen, die andere („Ereptase“) die gebildeten Peptone bis zur Stufe der Aminosauren hydrolysieren sollte. Die Untersuchungen von Vines sind noch ohne Einhaltung einer definierten Wasserstoffionenkonzentration und mit rein qualitativen Methoden zur Beurteilung der Enzymwirkung durchgefuhrt worden. Die von ihm angegebenen Verfahren zur Zerlegung der angenommenen Gemische haben der Nachprufung mit besseren analytischen Methoden nicht standgehalten (Willstatter, Grassmann und O. Ambros 6, vgl. dazu auch K. G. Dernby 7), obwohl der Vinesschen Lehre von der Zusammensetzung pflanzlicher Proteasen in vielen Fallen beachtenswerte, sorgfaltige Beobachtungen zugrunde gelegen haben.

Blausäure-Aktivierung und -Hemmung pflanzlicher Proteasen

Fur die Protease aus dem Milchsaft von Carica Papaya hat Cyanwasserstoff die Bedeutung einer Kinase, die, in zeitlichem Verlauf mit dem Enzym reagierend, seine Aktivitat erhoht und zudem seinen Spezifitatsbereich erweitert. Das Papain wirkt peptonisierend, es vermag Gelatine zu hydrolysieren, indessen nicht tiefgreifend, aber es ist nicht imstande, Peptone abzubauen. Das Papaincyanhydrin hydrolisiert Gelatine weitgehend, es spaltet Peptone. Zu diesem Spezifitatsunterschied, von dem unsere erste Mitteilung1 handelte, kommt ein weiterer hinzu; Papain selbst wirkt nicht auf genuines Eieralbumin, wahrend es zusammen mit Blausaure dazu imstande ist. Papain ohne Aktivator kann wegen seiner engeren Spezifitat mit Trypsin verglichen werden, andererseits sind die Systeme Papain + Blausaure und Trypsin + Enterokinase, insofern sie sowohl peptonbildend wie auch peptonspaltend sind, als Analoge zu betrachten. Unter Trypsin ist hier im Sinne der letzten [287] Ergebnisse von E. Waldschmidt-Leitz und A. Harteneck 1) das erepsinfreie Enzym verstanden. Die Aktivierung des Papains durch Cyanwasserstoff ist eine so ausgepragte Erscheinung, das sie sich zur Kennzeichnung der proteolytischen Enzyme der Pflanzen besonders eignet. Der Vergleich pflanzlicher Proteasen, den wir im folgenden beginnen, zeigt, das es unter ihnen tryptische Enzyme gibt, die durch Blausaure aktiviert und solche, die durch sie gehemmt werden. Die verschiedenen Falle haben also das gemeinsame, das das Enzym durch die Verbindung mit dem Zusatzstoff Anderungen seines Reaktionsvermogens erleidet, sei es im Sinne der Vermehrung oder Verminderung seiner Aktivitat.

Über die Ereptische Komponente Einiger Pflanzenproteasen

Wahrend durch Arbeiten von E. Abderhalden und A. Schittenhelm 1, H. v. Euler 2, S. L. Iwanow 3 und anderen Forschern in Pflanzensamen echte Ereptasen durch die Wirkung auf einfache Peptide nachgewiesen sind, werden auch oft in den Untersuchungen von Botanikern, besonders bei S. H. Vines 4, dann ereptische Enzyme angenommen, wenn es sich um den Abbau von Peptonen (Pepton Witte, Albuminpepton Merck) handelt. Zur Vereinfachung und Klarung der von S. H. Vines aufgeworfenen Frage, ob die in den Pflanzen verbreiteten Proteasen Gemische aus peptonbildenden und peptonspaltenden Enzymen sind, soll aber der Begriff Ereptase im Sinne der neuen Erkenntnisse uber die „Spezifitat tierischer Proteasen“, wovon aus unserem Laboratorium E. Waldschmidt-Leitz und A. Harteneck 5 berichten, streng beschrankt werden auf die niedrigste Peptide spaltenden Enzyme.

Über die Einheitlichkeit Einiger Pflanzenproteasen

Im Laufe ausgedehnter und grundlicher Untersuchungen uber die eiweisabbauenden Enzyme der Pflanzen entwickelte S. H. Vines die Auffassung, Peptonbildung und Peptonspaltung seien verschiedenartigen Enzymen zuzuschreiben. Er unterschied zwei Gruppen am Eiweisabbau beteiligter Enzyme, wovon die einen auf hohere Proteine wie Fibrin und Albumin einwirken, sie unter Peptonbildung auflosend, die anderen ausschlieslich auf einfachere Proteine wie Albumosen und Peptone eingestellt sind, die sie bis zu Aminosauren hydrolysieren. Wahrend Vines oft die Wirkung gegenuber Pepton ohne diejenige auf Fibrin antraf, beobachtete er die fibrinlosende Wirkung stets mit der weitergehenden Peptolyse verbunden. Das peptonspaltende Enzym, dessen Verbreitung in pflanzlichen Organen und Geweben viel bedeutender zu sein schien, sollte oft fur sich allein vorkommen, das peptonbildende Enzym aber nur mit jenem vergesellschaftet. Diese Komponenten der Pflanzenproteasen unterschied Vines als Gruppen der Peptasen, die mit Pepsin, und der Ereptasen, die mit dem Erepsin von O. Cohnheim 1 zu vergleichen waren.

Über die Wirkungsweise der Hefepolypeptidase

Die peptidspaltenden Enzyme der Hefe lassen sich, wie vor kurzem gezeigt werden konnte 1, durch fraktionierte Adsorption an Tonerde in zwei Komponenten zerlegen, von denen die eine („Hefe-Dipeptidase“) in ihrer Wirkung auf die Hydrolyse von Dipeptiden beschrankt ist, wahrend die andere („Hefe-Polypeptidase“) Tri- und Tetrapeptide angreift und bis zur Dipeptidstufe, aber nicht daruber hinaus zerlegt. Dieses Ergebnis, das in dem neuerdings beobachteten unterschiedlichen Verhalten tyrosinhaltiger Dipeptide und Polypeptide gegenuber dem Pankreastrypsin eine bemerkenswerte Analogie gefunden hat (E. Waldschmidt-Leitz, W. Grassmann und H. Scheatter 2; Waldschmidt-Leitz und Mitarbeiter3) weist innerhalb der Gesamtheit der Peptide den Dipeptiden eine Sonderstellung hinsichtlich der enzymchemischen Angreifbarkeit zu, eine Sonderstellung, die ubrigens auch in einzelnen ihrer chemischen Eigenschaften zum Ausdruck zu [19] kommen scheint. Ob auserdem auch im Bereich hoherer und hoher Peptide Unterschiede der enzymatischen Angreifbarkeit vorkommen, die allein durch die Anzahl der Bausteine des Peptidmolekuls bedingt sind, scheint gegenwartig noch nicht genugend geklart. Die Frage, ob fur den Spezifitatsbereich der Hefepolypeptidase eine obere Grenze existiert und ob sie insbesondere mit dem tryptischen Enzym der Hefe identisch ist, haben wir einer eingehenden Prufung vorbehalten, uber deren Ergebnis wir demnachst berichten werden.

Über die Aktivierung des Papains durch Blausäure

Um die Mitte des 18. Jahrhunderts haben die naturgeschichtlichen Werke von Griffith Hughes 1 und Patrick Browne 2 die Aufmerksamkeit der europaischen Gelehrten auf die merkwurdige eiweisverdauernde Wirkung des Milchsaftes von Carica Papaya L. gelenkt. Die erste chemische Untersuchung des Papains unternahmen A. Wurtz und E. Bouchut 3 Sie wandten bei ihren Versuchen nach einem Gebrauch der franzosischen Physiologen als Antisepticum Blausaure an. Diese Arbeitsweise ubernahm der englische Botaniker S. H. Vines, der anknupfend an seine Untersuchung4 uber das peptische Enzym von Nepenthes eine [185] sorgfaltige Arbeit1) uber Papain in Angriff nahm und in einer Reihe eindringender und bedeutender Untersuchungen auf die proteolytischen Enzyme des Pflanzenreichs ausdehnte. Seitdem ist eine weitere Anzahl von Untersuchungen uber Papain erschienen, darunter die von L. B. Mendel und A. F. Blood 2) und die von E. M. Frankel 3), worin die Blausaure nicht mehr als desinfizierendes Mittel, sondern, klar erkannt, als Aktivator Anwendung fand.

Substrat und Aktivitätsoptimum bei einigen Proteolytischen Reaktionen

Nach einer bedeutsamen Untersuchung von J. H. Northrop 1 sollen fur Pepsin, das nur mit Eiweiskationen, und fur Trypsin, das mit Anionen reagiert, die Dissoziationskurven der Proteinsubstrate und die Aktivitats-p H-Kurven der darauf einwirkenden Enzyme ubereinstimmen. Daraus leitet R. Kuhn, indem er die elektrische Ladung der Reaktionszwischenprodukte fur die Geschwindigkeit der Proteolysen als masgebend erachtet, den Satz ab: „Bei den Proteasen wird die elektrochemische Natur der Ferment-Substratverbindung vor allem durch die elektrochemische Natur des Substrates bestimmt.“2

Über die Spezifität der Hefe-Peptidasen

Die proteolytischen Wirkungen der Hefe und ihrer Auszuge werden in einer wichtigen Untersuchung von K. G. Dernby 1 zuruckgefuhrt auf ein System aus drei Einzelkomponenten, namlich: I. dem „Hefepepsin“, das bei schwach saurer Reaktion (Optimum p H = 4,5) Eiweisstoffe bis zur Peptonstufe, aber nicht daruber hinaus, hydrolysieren soll; 2. dem „Hefetrypsin“, das die Spaltung von Proteinen bei neutraler Reaktion (Optimum p H = 7) vollzieht, und 3. dem „Hefeerepsin“, dessen spezifische Wirkungsweise und p H-Abhangigkeit der des Darmerepsins entsprechen soll.

Adsorptionsverhalten und Trennung der Hefeproteasen

Die Trennung des dipeptidspaltenden und des tryptischen Enzyms der Hefe gelingt nach den Befunden von R. Willstatter und W. Grassmann 1 auf Grund der verhaltnismasig geringfugigen quantitativen Unterschiede, welche die beiden Proteasen bei der Adsorption an Tonerde aufweisen. In schwach saurer Losung wird namlich das tryptische Enzym leicht, das ereptische erheblich schwerer von Aluminiumhydroxyd aufgenommen und bei wiederholter Adsorption gelingt es, einen Teil des peptidspaltenden Enzyms in der Restlosung frei von tryptischer Wirkung zuruckzubehalten, wahrend das Hefetrypsin aus den Adsorbaten durch Ammoniak vollig oder doch nahezu unwirksam gegen Leucylglcyin erhalten werden kann. Der Erfolg dieses Trennungsverfahrens ist indessen von der richtigen Bemessung der Tonerdemengen, von den Reaktionsbedingungen und von dem Zustand der Enzymlosung entscheidend abhangig. Fur die Zwecke der Spezifitatsuntersuchung, uber deren Ergebnis die folgende Mitteilung berichtet, schien es daher notwendig, die Darstellung der einheitlichen Proteasen auf eine [189] ausfuhriichere Untersuchung ihres Adsorptionsverhaltens zu grunden.